朱婧,趙義康,王臻,常建華,張世平

(陜西省人民醫(yī)院麻醉科,陜西 西安 710000)

腦缺血再灌注(I/R)損傷是一種由多種因素引起的病理過程，與腦細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)[1-3]。NF-κB信號通路是一種與細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)關(guān)系密切的經(jīng)典信號傳導(dǎo)途徑[4-6]。有研究發(fā)現(xiàn)，異氟烷(ISO)預(yù)處理可通過抑制腦細(xì)胞凋亡和減弱炎癥反應(yīng)等機制改善腦I/R損傷[7-8]。但NF-κB信號通路是否與ISO的保護(hù)機制有關(guān)尚不清楚。因此，本研究旨在探究ISO對I/R損傷的影響以及對NF-κB信號通路的調(diào)控作用。本研究利用NF-κB信號通路抑制劑，通過觀察ISO對I/R大鼠腦細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)及NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探討ISO保護(hù)腦I/R損傷的作用機制是否與NF-κB信號通路有關(guān)?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SD雄性大鼠(體質(zhì)量260～300 g，2～3周齡)購于空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，ISO購于美國Baxter公司。細(xì)胞裂解液、硝酸纖維素膜、顯影液、定影液和BCA蛋白濃度測定試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)研究所，NF-κB p65兔多克隆抗體購于美國MILLIPORE公司，B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)兔多克隆抗體和兔源二抗購于美國Cell Signaling公司。NF-κB信號通路抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸銨(PDTC)購于美國Sigma公司，腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素1β(IL-1β)ELISA試劑盒購于德國R&D Germany公司。

1.2 實驗方法

1.2.1I/R模型的制備、ISO預(yù)處理與實驗分組I/R模型的制備：以腹腔注射30 g/L戊巴比妥鈉的方法麻醉大鼠，固定大鼠去除頸前毛，并以體積分?jǐn)?shù)0.75乙醇溶液對頸部皮膚進(jìn)行消毒。在頸正中做切口，分離右側(cè)頸總動脈以及頸內(nèi)外動脈，將尼龍線栓(直徑0.38 mm)從頸外動脈殘端插入頸內(nèi)動脈(約長20 mm)直至有阻力感。在缺血90 min后，拔出線栓，進(jìn)行再灌注24 h。I/R大鼠模型制備成功的判斷參照LONGA等[9]的標(biāo)準(zhǔn)。預(yù)處理方法：ISO組在I/R前進(jìn)行ISO預(yù)處理，將大鼠置于自制密閉的實驗艙中，頭端分別連接進(jìn)氣孔和連接麻醉氣體監(jiān)測儀。維持箱內(nèi)溫度35～37 ℃，經(jīng)麻醉機輸送體積分?jǐn)?shù)0.015的ISO氣體至實驗艙內(nèi)，并調(diào)節(jié)氧體積分?jǐn)?shù)為0.70左右，逐漸升高麻醉氣體濃度，根據(jù)Datex氣體檢測儀調(diào)節(jié)實驗艙內(nèi)ISO濃度為體積分?jǐn)?shù)0.015時，維持以上濃度穩(wěn)定15 min后放入大鼠進(jìn)行預(yù)處理。連續(xù)5 d吸入體積分?jǐn)?shù)0.015的ISO氣體，每天1 h。吸入ISO氣體過程中分別監(jiān)測脈搏氧分壓(SpO2)和脈率。末次預(yù)處理24 h后行I/R。

實驗分組：將50只大鼠隨機分為5組，每組10只。①假手術(shù)組(A組)：分離血管后不插入線栓。②I/R組(B組)：參照I/R模型的制備方法制備腦中動脈閉塞/再灌注(MCAO/R)大鼠模型，在缺血90 min后再灌注。③I/R+ISO組(C組)：在缺血前60 min給予體積分?jǐn)?shù)0.02的ISO誘導(dǎo)30 min，之后行I/R。④I/R+ISO+PDTC組(D組)：缺血前60 min給予體積分?jǐn)?shù)0.02的ISO誘導(dǎo)30 min，并于側(cè)腦注射10 μL的NF-κB信號通路特異性抑制劑PDTC(以二甲基亞砜(DMSO)溶解，0.3 mg/kg)，然后再行I/R。⑤I/R+ISO+DMSO組(E組)：缺血前60 min給予體積分?jǐn)?shù)0.02的ISO誘導(dǎo)30 min，并于側(cè)腦注射10 μL的DMSO，再行I/R。

1.2.2神經(jīng)功能損傷和TMS評分 采用Longa評分法對缺血再灌注后24 h的各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評估。神經(jīng)功能損傷評分：無神經(jīng)損傷記為0分，左前肢出現(xiàn)伸展障礙記為1分，向左打圈記為2分，行走時向左側(cè)傾斜記為3分，意識昏迷記為4分，死亡記為5分；評分越高神經(jīng)功能損傷程度越嚴(yán)重。TMS評分：各組大鼠在再灌注后2 h進(jìn)行TMS評分，參照LONGA等[9]報道的方法對大鼠抓屏、抓繩和平衡木等3個項目的檢測，評分越高表明神經(jīng)運動功能越好。

1.2.3TTC法檢測梗死面積 在各組大鼠處理結(jié)束后，脫臼處死大鼠。取腦組織，并做厚度為2 mm的冠狀組織切片，以10 g/L的TC溶液染色15～20 min，其中呈紅色的為正常腦組織，呈白色的為梗死區(qū)域腦組織。以40 g/L多聚甲醛進(jìn)行固定。采用Image-Pro Plus 6.0軟件對染色切片進(jìn)行分析。梗死面積(%)=白色區(qū)域面積/(白色區(qū)域面積+紅色區(qū)域面積)×100%。

1.2.4TUNEL法檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡 采用40 g/L多聚甲醛對各組大鼠腦組織固定后，以石蠟進(jìn)行包埋切片。根據(jù)TUNEL試劑盒說明書步驟進(jìn)行染色。其中，呈綠色熒光的為陽性細(xì)胞。在400倍光鏡下隨機選取5個視野統(tǒng)計陽性細(xì)胞數(shù)，以陽性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比值表示神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率。

1.2.5Western blot檢測海馬組織中NF-κB p65、Bcl-2和Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá) 向各組腦組織勻漿中加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，經(jīng)BCA法定量總蛋白后，將蛋白樣品上樣至SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳。待完全分離后，結(jié)束電泳。恒流轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜后，加入1∶1 000的特異性一抗(NF-κB p65、Bcl-2和Cleaved Caspase-3)4 ℃下孵育2 h。次日，加入1∶2 000的辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。暗室內(nèi)顯影曝光后，以GAPDH為對照，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

1.2.6ELISA法檢測腦組織中TNF-α和IL-1β的含量 取各組大鼠的腦組織制備勻漿，嚴(yán)格參照ELISA試劑盒說明書步驟檢測各組大鼠腦組織中TNF-α和IL-1β的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組神經(jīng)功能的比較

與假手術(shù)組比較，其余4組的神經(jīng)功能損傷評分明顯升高，而TMS評分明顯降低(F=38.626、404.130，P<0.05)；與I/R組相比，I/R+ISO組、I/R+ISO+PDTC組和I/R+ISO+DMSO組的神經(jīng)功能損傷評分均明顯降低，而TMS評分明顯升高(q=7.776～15.231,P<0.05)；與I/R+ISO組相比，I/R+ISO+PDTC組的神經(jīng)功能損傷評分明顯降低，而TMS評分明顯升高(q=4.030、12.124,P<0.05)，但I(xiàn)/R+ISO+DMSO組無顯著差異(q=0.403、0.501,P>0.05)。見表1。

表1 各組神經(jīng)功能評分比較

2.2 各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率與腦組織梗死面積的比較

I/R組、I/R+ISO組、I/R+ISO+PDTC組和I/R+ISO+DMSO組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率和腦組織梗死面積較假手術(shù)組均明顯升高(F=111.952、272.910，P<0.05)。I/R+ISO組、I/R+ISO+PDTC組和I/R+ISO+DMSO組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率和腦組織梗死面積較I/R組均明顯降低(q=11.361～19.237,P<0.05)；并且，I/R+ISO+PDTC組明顯低于I/R+ISO組(q=5.248、9.211,P<0.05)，而I/R+ISO+DMSO組與I/R+ISO組比較差異無顯著意義(q=1.040、1.348,P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率與腦組織梗死面積的比較

2.3 各組大鼠海馬組織中NF-κB p65、Bcl-2以及Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的比較

與假手術(shù)組大鼠相比，其余4組中NF-κB p65和Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)水平均明顯升高，而Bcl-2蛋白的表達(dá)水平均明顯降低(F=43.929～114.750，P<0.05)。同時，與I/R組相比，除假手術(shù)組外的另外3組中NF-κB p65和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高(q=9.192～12.328,P<0.05)；并且，在I/R+ISO+PDTC組中上述變化幅度明顯小于I/R+ISO組(q=5.527～9.900,P<0.05)，而I/R+ISO組與I/R+ISO+DMSO組無顯著差異(q=0.850～1.414,P>0.05)。見圖1和表3。

A：假手術(shù)組，B：I/R組，C：I/R+ISO組，D：I/R+ISO+PDTC組，E：I/R+ISO+DMSO組。

表3 各組腦組織相關(guān)蛋白比較

2.4 各組大鼠腦組織中炎癥因子TNF-α和IL-1β含量的比較

與假手術(shù)組相比，其余4組中TNF-α和IL-1β含量均明顯升高(F=20.613、30.197，P<0.05)。I/R+ISO組、I/R+ISO+PDTC組和I/R+ISO+DMSO組中TNF-α和IL-1β含量較I/R組均明顯降低(q=5.244～7.381,P<0.05)。同時，I/R+ISO+PDTC組明顯低于I/R+ISO組(q=3.580、3.628,P<0.05)，而I/R+ISO+DMSO組與I/R+ISO組比較差異無顯著性(q=0.218、0.636,P>0.05)。見表4。

表4 各組腦組織TNF-α和IL-1β含量比較

3 討 論

在I/R過程中，中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等可通過釋放TNF-α、IL-1β等炎癥因子啟動炎癥反應(yīng)的發(fā)生，加重細(xì)胞損傷，而炎癥因子的釋放受多種信號通路調(diào)控[10-13]。另外，神經(jīng)細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致腦I/R損傷的重要環(huán)節(jié)，而信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡啟動的重要前提[14-15]。因此，尋找有效抑制細(xì)胞凋亡和改善炎癥反應(yīng)的信號靶點對減輕腦I/R損傷具有重要意義。

眾所周知，NF-κB是廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的多效核轉(zhuǎn)錄因子，p65是其重要的功能性亞單位，翻譯后修飾能夠精細(xì)地激活NF-κB信號通路，進(jìn)而調(diào)控多種細(xì)胞基因，參與細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡、炎癥和免疫反應(yīng)等過程[16-17]。目前多項研究顯示，NF-κB與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤和心血管疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[18-20]，是多種藥物介入方面潛在的靶標(biāo)。

ISO是一種揮發(fā)性麻醉劑，一項研究證實ISO預(yù)處理可通過激活A(yù)kt/mTOR/s6K信號通路減輕I/R損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)功能缺損、梗死體積、腦水腫和細(xì)胞凋亡等[7]。PENG等[21]指出，ISO通過TGF-β2/Smad3信號通路增強VEGF和CD34的活化來減輕I/R損傷。此外，ISO還能夠有效緩解大鼠腦I/R損傷[22]。ZHAO等[23]研究結(jié)果顯示，在腦I/R損傷后大鼠腦組織中NF-κB信號通路被激活，腦梗死體積增大和病理改變加重，神經(jīng)功能障礙明顯，而抑制NF-κB信號通路后，大鼠腦I/R損傷可明顯減輕。ZHANG等[24]研究顯示，脂聯(lián)素通過抑制海馬中的P38-MAPK信號通路來改善ISO引起的老年大鼠認(rèn)知功能障礙。另一項研究顯示，ISO誘導(dǎo)CUMS小鼠中BDNF-TrkB信號傳導(dǎo)產(chǎn)生抗抑郁作用[25]。以上研究提示，ISO能夠調(diào)控不同信號通路在多種疾病中發(fā)揮作用。

本研究通過構(gòu)建I/R損傷大鼠模型，ISO預(yù)處理后I/R損傷大鼠TMS評分、Bcl-2表達(dá)水平均明顯升高，而神經(jīng)功能損傷評分、神經(jīng)細(xì)胞凋亡率和腦組織梗死面積、NF-κB p65和Cleaved Caspase-3表達(dá)水平、TNF-α和IL-1β含量均明顯降低。Bcl-2是公認(rèn)的抑凋亡基因，Caspase-3是凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行因子，活化的Caspase-3以Cleaved Caspase-3形式存在；兩者均在腦I/R損傷的細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用[26-27]。本文結(jié)果提示，ISO預(yù)處理可通過抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡和減弱炎癥反應(yīng)以發(fā)揮保護(hù)腦I/R損傷的作用。而以NF-κB信號通路抑制劑PDTC作用后，I/R損傷大鼠的TMS評分、Bcl-2表達(dá)水平均進(jìn)一步升高，而神經(jīng)功能損傷評分、神經(jīng)細(xì)胞凋亡率和腦組織梗死面積、NF-κB p65和Cleaved Caspase-3表達(dá)水平、TNF-α和IL-1β含量進(jìn)一步降低。本文研究結(jié)果表明，ISO對腦I/R損傷的保護(hù)作用進(jìn)一步增強。提示，ISO可通過抑制NF-κB信號通路減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡和減輕炎癥反應(yīng)，進(jìn)而減輕腦I/R損傷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，NF-κB信號通路在腦I/R損傷過程中發(fā)揮著重要作用，ISO預(yù)處理可通過抑制其激活抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)來減輕腦I/R損傷。本研究為腦I/R損傷發(fā)病機制的深入研究提供實驗依據(jù)，并為ISO用于腦I/R損傷治療提供一定的理論基礎(chǔ)。然而，本實驗未涉及ISO是否調(diào)控其他信號通路尚顯不足，后續(xù)研究將對此進(jìn)行補充和完善，且大鼠體內(nèi)實驗與臨床試驗也有一定差距，ISO用于腦I/R損傷治療仍然需要大量的研究。