薛娟，馬曉

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┦切难芗膊≈谐Ｒ姷囊环N疾病，研究顯示，心血管病死亡占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位，嚴(yán)重威脅人們的生命健康[1]，其主要病理特征是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂伴隨血栓形成和心肌缺血[2]。因此，消除或控制動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素，對(duì)于預(yù)防冠心病至關(guān)重要。動(dòng)脈粥樣硬化主要特征是中動(dòng)脈和大動(dòng)脈血管壁膽固醇的局部蓄積形成斑塊和機(jī)體炎癥反應(yīng)[3]。新血管形成在斑塊生長(zhǎng)和不穩(wěn)定中起主要作用。研究顯示，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）與其受體VEGFR2結(jié)合在血管內(nèi)皮細(xì)胞中參與血管生成過程[4,5]。研究報(bào)道，抑制VEGFs/VEGFRs信號(hào)通路可減少血管新生，穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊[6]。促紅細(xì)胞生成素衍生肽（HBSP）是促紅細(xì)胞生成素衍生的一種螺旋B表面活性肽，有促紅細(xì)胞生成素抗炎、抗氧化等作用，但無高血壓、紅細(xì)胞增多癥、血栓形成等不良反應(yīng)[7]，在治療急性心肌梗死、心肌缺血再灌注損傷疾病中發(fā)揮重要作用[8,9]，HBSP在冠心病中對(duì)新生血管影響的研究報(bào)道較少，本研究通過觀察HBSP對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化心肌缺血大鼠模型的作用，初步探討其治療冠心病的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF清潔級(jí)SD雄性大鼠，8周齡，體重約250 g，由北京生命科學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)為SYXK（京）2015-0002，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑及儀器 HBSP由上?？齐纳镉邢薰咎峁兌?8.12%）；鹽酸異丙腎上腺素（北京索萊寶科技有限公司 貨號(hào)：SI9030）；C反應(yīng)蛋白（CRP）ELISA試劑盒（上海一研生物科技有限公司 貨號(hào)：EY-elisa-0694）；白介素-6（IL-6）ELISA試劑盒（貨號(hào)：ml102828）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒（貨號(hào)：ml059784）購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；RNA提取試劑盒（Trizol法）（北京艾德萊生物科技公司 貨號(hào)：RN0401）；兔源多克隆VEGF抗體（貨號(hào)：PA5-16754）、兔源單克隆VEGFR2抗體（中國(guó)賽默飛世爾科技有限公司 貨號(hào)：MA5-15157）；兔源單克隆抗β-actin抗體（美國(guó)CST公司 貨號(hào)：3700S）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（美國(guó)R&D/Prosci/NovusBiologicals公司 貨號(hào)：YB-19442）；顯微鏡（上海炳宇光學(xué)儀器有限公司 型號(hào)：XDS-10）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司 型號(hào)：ChemiDocXRS）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠模型構(gòu)建及分組 將40只SD大鼠隨機(jī)分6組：對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照組、HBSP低、高劑量組，每組各10只，除對(duì)照組外，其余組大鼠構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化心肌缺血大鼠模型，參考相關(guān)文獻(xiàn)大鼠分別在第0、2、4周腹腔注射D3（60 U/kg），同時(shí)飼養(yǎng)高脂飼料4周，第5周灌胃高脂乳劑（10 ml/kg），連續(xù)4周。于造模的第1 d給藥，HBSP低、中、高劑量組：腹腔注射25 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg HBSP，陽性對(duì)照組：灌胃辛伐他丁2 mg/kg，對(duì)照組和模型組：腹腔注射等量生理鹽水，給藥24 h后，8周后背部皮下注射鹽酸異丙腎上腺素（100 mg/kg·d），對(duì)照組皮下注射等量生理鹽水，連續(xù)注射2 d。大鼠心電圖ST段升高則造模成功，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 標(biāo)本采集 給藥24 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，取腹腔主動(dòng)脈血10 ml于離心管中，離心取上清（即血清）-80℃冰箱中待測(cè)；處死大鼠，分離主動(dòng)脈組織，剪取約0.5 g用于提取組織蛋白，-80℃冰箱中備用，剩余組織用4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟切片備用。用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。用ELISA試劑盒分別檢測(cè)炎性因子CRP、IL-6、TNF-α含量，操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。主動(dòng)脈組織切片脫蠟至水化，CD31染色觀察大鼠新生血管形態(tài)變化，組織中細(xì)胞陽性呈黃色或棕褐色，通過Image J軟件檢測(cè)陽性細(xì)胞平均光密度值（MOD），反映新生血管密度。

1.3.3 Western blot法檢測(cè)各組大鼠主動(dòng)脈組織中VEGF、VEGFR2蛋白水平 提取主動(dòng)脈組織蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，調(diào)整上樣蛋白至50 μg，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，轉(zhuǎn)膜，加一抗（VEGF、VEGFR2、β-actin抗體，1:1000），4℃孵育過夜，次日加二抗（1:5000）室溫孵育2 h，洗膜，加ECL發(fā)光液，用Bio-Rad成像系統(tǒng)采集圖像，以β-actin為內(nèi)參照，Image J軟件定量分析蛋白灰度信號(hào)，計(jì)算蛋白表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBSP對(duì)各組大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，模型組大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平顯著升高（P＜0.05），HDL-C水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，HBSP低、中、高劑量組大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平顯著降低（P＜0.05），HDL-C水平顯著升高（P＜0.05）；與陽性對(duì)照組相比，HBSP低、中劑量組大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平顯著升高（P＜0.05），HDL-C水平顯著降低（P＜0.05）；與HBSP低、中劑量組相比，HBSP高劑量組大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平顯著降低（P＜0.05），HDL-C水平顯著升高（P＜0.05），表1。

2.2 HBSP對(duì)各組大鼠血清中CRP、IL-6、TNF-α表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，模型組大鼠血清中CRP、IL-6、TNF-α含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，HBSP低、中、高劑量組大鼠血清中CRP、IL-6、TNF-α含量顯著降低（P＜0.05）；與陽性對(duì)照組相比，HBSP低、中、高劑量組大鼠血清中CRP、IL-6、TNF-α含量顯著升高（P＜0.05）；與HBSP低、中劑量組相比，HBSP高劑量組大鼠血清中CRP、IL-6、TNF-α含量顯著降低（P＜0.05），表2。

2.3 HBSP對(duì)各組大鼠新生血管密度的影響 與對(duì)照組相比，模型組大鼠主動(dòng)脈組織中CD31 MOD表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，HBSP低、中、高劑量組鼠主動(dòng)脈組織中CD31 MOD表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與陽性對(duì)照組相比，HBSP低、中劑量組鼠主動(dòng)脈組織中CD31 MOD表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與HBSP低、中劑量組相比，HBSP高劑量組鼠主動(dòng)脈組織中CD31 MOD表達(dá)顯著降低（P＜0.05），（圖1、表3）。

2.4 HBSP對(duì)各組大鼠主動(dòng)脈組織中VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，模型組大鼠主動(dòng)脈組織中VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，HBSP低、高劑量組鼠主動(dòng)脈組織中VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與陽性對(duì)照組相比，HBSP低、高劑量組鼠主動(dòng)脈組織中VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與HBSP低、中劑量組相比，HBSP高劑量組鼠主動(dòng)脈組織中VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），（圖2、表4）。

表1 HBSP對(duì)各組大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C表達(dá)的影響（±s，mmol/L）

表1 HBSP對(duì)各組大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C表達(dá)的影響（±s，mmol/L）

注：TC：總膽固醇；TG：三酰甘油；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；與對(duì)照組相比，a P＜0.05；與模型組相比，b P＜0.05；與陽性對(duì)照組相比，c P＜0.05；與HBSP低劑量組相比，d P＜0.05；與HBSP中劑量組相比，e P＜0.05

組別 n TC TG LDL-C HDL-C對(duì)照組 10 1.42±0.05 0.64±0.04 0.20±0.02 0.39±0.03模型組 10 1.87±0.06a 1.08±0.03a 0.37±0.01a 0.23±0.02a陽性對(duì)照組 10 1.62±0.05ab 0.70±0.02ab 0.23±0.01ab 0.33±0.03ab HBSP低劑量組 10 1.75±0.07abc 0.83±0.06abc 0.34±0.03abc 0.27±0.02abc HBSP中劑量組 10 1.73±0.05abc 0.80±0.04abc 0.32±0.02abc 0.29±0.03abc HBSP高劑量組 10 1.63±0.04abde 0.72±0.05abde 0.24±0.03abde 0.34±0.02abde F值 - 79.500 137.151 101.714 49.487 P值 - 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 HBSP對(duì)各組大鼠血清中CRP、IL-6、TNF-α表達(dá)的影響（±s）

表2 HBSP對(duì)各組大鼠血清中CRP、IL-6、TNF-α表達(dá)的影響（±s）

注：CRP：C反應(yīng)蛋白；IL-6：白介素-6；TNF-α：腫瘤壞死因子α；與對(duì)照組相比，a P＜0.05；與模型組相比，b P＜0.05；與陽性對(duì)照組相比，c P＜0.05；與HBSP低劑量組相比，d P＜0.05；與HBSP中劑量組相比，e P＜0.05

組別 n CRP（ng/ml） IL-6（pg/ml） TNF-α（pg/ml）對(duì)照組 10 3024.56±107.32 203.17±8.34 300.27±6.01模型組 10 3601.28±123.24a 241.32±5.17a 357.21±9.21a陽性對(duì)照組 10 3196.14±121.75ab 215.43±9.24ab 310.15±7.69ab HBSP低劑量組 10 3418.25±116.36abc 232.03±6.64abc 334.16±9.32abc HBSP中劑量組 10 3397.31±135.42abc 230.13±7.67abc 329.59±9.85abc HBSP高劑量組 10 3207.14±129.74abde 220.16±8.59abde 314.47±6.03abde F值 - 27.307 30.927 62.426 P值 - 0.000 0.000 0.000

圖1 各組大鼠主動(dòng)脈組織免疫組化圖（×100）

表3 HBSP對(duì)各組大鼠新生血管密度的影響（±s）

表3 HBSP對(duì)各組大鼠新生血管密度的影響（±s）

注：與對(duì)照組相比，a P＜0.05；與模型組相比，b P＜0.05；與陽性對(duì)照組相比，c P＜0.05；與HBSP低劑量組相比，d P＜0.05；與HBSP中劑量組相比，e P＜0.05

組別 n CD31 MOD對(duì)照組 10 0.09±0.01模型組 10 0.31±0.03a陽性對(duì)照組 10 0.20±0.02ab HBSP低劑量組 10 0.27±0.01abc HBSP中劑量組 10 0.26±0.02abc HBSP高劑量組 10 0.21±0.03abde F值 - 126.571 P值 - 0.000

圖2 各組大鼠主動(dòng)脈組織中VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)圖（A：對(duì)照組；B：模型組；C：陽性對(duì)照組；D：HBSP低劑量組；E：HBSP中劑量組；F：HBSP高劑量組）

表4 HBSP對(duì)各組大鼠主動(dòng)脈組織VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)的影響（±s）

表4 HBSP對(duì)各組大鼠主動(dòng)脈組織VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：與對(duì)照組相比，a P＜0.05；與模型組相比，b P＜0.05；與陽性對(duì)照組相比，c P＜0.05；與HBSP低劑量組相比，d P＜0.05；與HBSP中劑量組相比，e P＜0.05

組別 n VEGF/β-actin VEGFR2/β-actin對(duì)照組 10 0.75±0.02 0.83±0.04模型組 10 1.13±0.04a 1.15±0.05a陽性對(duì)照 10 0.86±0.03ab 0.87±0.03ab HBSP低劑量組 10 1.02±0.03abc 1.03±0.04abc HBSP中劑量組 10 1.00±0.04abc 1.01±0.02abc HBSP高劑量組 10 0.87±0.02abde 0.89±0.03abde F值 - 193.414 112.937 P值 - 0.000 0.000

3 討論

研究顯示，早發(fā)冠心病患者外周血中hs-CRP、TG水平明顯升高，apoA1、HDL-C水平明顯降低，可作為該病預(yù)測(cè)指標(biāo)[10]。研究發(fā)現(xiàn)，模型組較對(duì)照組大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低，提示冠心病的發(fā)生引起血脂紊亂。HBSP是衍生自促紅細(xì)胞生成素螺旋B結(jié)構(gòu)域的小肽，可保護(hù)組織免受血壓升高和血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)[11]。Lin等[12]研究顯示，HBSP保留了促紅細(xì)胞生成素的組織保護(hù)特性，且不改變血細(xì)胞比容，有效治療糖尿病性心肌病。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，HBSP低、高劑量組大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平依次降低，HDL-C水平依次升高，提示HBSP可改善冠心病大鼠機(jī)體血脂水平。

炎癥包括斑塊形成、進(jìn)展、不穩(wěn)定和破裂等過程[13]。CRP是炎癥的生物標(biāo)記物，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展中積累，可識(shí)別和結(jié)合多種內(nèi)在配體來促進(jìn)心血管疾病的進(jìn)展[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組較對(duì)照組大鼠血清中CRP、IL-6、TNF-α含量顯著升高，提示冠心病的發(fā)生造成機(jī)體炎癥反應(yīng)。HBSP具有較好的抗炎特性，Zhang等[15]研究顯示，HBSP在機(jī)體抗炎過程中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，HBSP低、中、高劑量組鼠血清中CRP、IL-6、TNF-α含量顯著降低，提示HBSP可緩解冠心病大鼠機(jī)體炎癥反應(yīng)，與陽性對(duì)照組相比，HBSP低、中劑量組鼠血清中CRP、IL-6、TNF-α含量顯著升高，高劑量組無顯著變化，提示HBSP的抗炎作用與其劑量有關(guān)且高劑量HBSP與陽性藥物藥效相似。

抑制血管新生是維持脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定的重要途徑，生理狀態(tài)下，血管網(wǎng)存在于動(dòng)脈壁的外膜、中膜外層，但硬化發(fā)生時(shí)，血管平滑肌細(xì)胞活化、增殖，炎癥反應(yīng)加劇，VEGF、VEGFR2等因子被激活，促進(jìn)新生血管增生，新生血管結(jié)構(gòu)不完整，炎性細(xì)胞等活性物質(zhì)侵入新血管增加斑塊的易損性。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組較對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈組織中CD31 MOD，VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)顯著升高，提示VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)與冠心病大鼠動(dòng)脈組織中新生血管增多有關(guān)。與模型組相比，HBSP低、中、高劑量組大鼠主動(dòng)脈組織中CD31 MOD，VEGF、VEGFR2顯著降低，提示HBSP可抑制VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)，從而抑制動(dòng)脈組織中血管新生。

綜上所述，HBSP通過抑制VEGF/VEGFR通路，抑制冠心病大鼠血管新生，減少炎性因子分泌，穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。但HBSP的生物活性較多，需進(jìn)一步研究其在心血管疾病中的作用，以其為臨床提供理論基礎(chǔ)。