周敏，蒲升慧，劉福權(quán)，趙志峰，呂遠平

(四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610065)

花椒(Zanthoxylumbungeanum)是蕓香科花椒屬植物，全世界約有250個花椒品種[1]?；ń吩谖覈哂袕V泛的應(yīng)用和悠久的栽培歷史，它是中國烹飪文化和四川美食的傳統(tǒng)調(diào)味品之一，具有獨特的麻味[2-3]。據(jù)研究報道，花椒中的化學(xué)成分包括生物堿類、酰胺類、揮發(fā)油、木脂素、香豆素、黃酮類及多酚類等[4-6]，花椒的刺痛感和麻木感是由酰胺類物質(zhì)即麻味物質(zhì)所引起的，它是評價花椒品質(zhì)的重要指標[7]。目前，溶劑提取法廣泛應(yīng)用于麻味物質(zhì)的提取，但存在著提取時間長、提取率低或費用高等缺點[8-9]。研究者報道了超聲波技術(shù)[10]和酶法[11]可用于花椒麻味物質(zhì)的提取工藝，超聲波利用其空化作用和機械效應(yīng)對原料進行破碎，促進胞內(nèi)的麻味物質(zhì)擴散、溶出；酶能夠水解纖維素，促進麻味物質(zhì)的溶出，并且多種酶混合使用可能具有協(xié)同作用，提取效率優(yōu)于單一酶處理[12]。超聲波協(xié)同復(fù)合酶法能有效避免常規(guī)溶劑提取法的缺陷，但對于超聲波協(xié)同復(fù)合酶提取麻味物質(zhì)的研究還未見相關(guān)報道。

因此，本文在傳統(tǒng)溶劑提取法的基礎(chǔ)上增加超聲波與復(fù)合酶處理，采用混料設(shè)計與響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化花椒麻味物質(zhì)的提取工藝，以達到高效提取花椒麻味物質(zhì)的目的，實現(xiàn)花椒資源的高效利用。

1 材料、儀器與方法

1.1 材料與儀器

實驗原料：干燥的紅花椒果皮，收獲于2019年9月，由四川五豐黎紅食品有限公司提供。將其粉碎過40目篩，并存放于-18 ℃冰箱備用。

主要試劑：纖維素酶(EC 3.2.1.4，50 U/mg)、半纖維素酶(EC 3.2.1.78，20 U/mg)、果膠酶(EC 3.2.1.15，500 U/mg)：均為分析級，購于源葉生物科技有限公司；食用酒精(95%)：購于河南鑫河陽酒精有限公司；戊二醛和磷酸：均為分析試劑，購于成都市科龍化工試劑廠。

主要儀器：SHA-B水浴恒溫振蕩器 江蘇金城國勝實驗儀器廠；KQ-300VD三頻數(shù)控超聲波清洗機 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海道京儀器有限公司；TD25-WS離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司；LC-6AD高效液相色譜儀 日本島津公司；JSM-7500F場發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本電子株式會社(JEOL)。

1.2 實驗方法

1.2.1 花椒麻味物質(zhì)的提取工藝

50 g花椒粉經(jīng)500 mL超純水蒸餾提取后，過濾料液并收集花椒殘渣，稱其重量記為M1。取20 g花椒殘渣和200 mL超純水混合并在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中水解3 h，溫度控制在(40±1) ℃，pH 4.8±0.2(采用10 mg/mL檸檬酸進行調(diào)節(jié))。水解完成后，加入200 mL食用酒精，在(50±1)℃條件下浸提3 h，減壓抽濾并收集濾液，經(jīng)減壓蒸干后，收集剩余成分，即麻味粗提物。向麻味粗提物中加入100 mL食用酒精，振蕩使其溶解后于4000 r/min條件下離心15 min，收集上清液，再通過減壓蒸干收集浸膏狀成分，即麻味物質(zhì)，稱其重量記為M2。麻味物質(zhì)提取率的計算公式如下：

麻味物質(zhì)提取率(%，W/W)=[(M1×M2)/(20×50)]×100。

(1)

1.2.2 花椒麻味物質(zhì)提取工藝優(yōu)化

1.2.2.1 復(fù)合酶混料設(shè)計

利用Design-Expert 8軟件中混料設(shè)計(單行格子設(shè)計{3,2})篩選纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶的最佳配比，以3種酶的占比為自變量，麻味物質(zhì)提取率為響應(yīng)值?；炝显O(shè)計實驗因素水平見表1。

表1 混料設(shè)計實驗因素水平表Table 1 The factors and levels of mixture design test

1.2.2.2 響應(yīng)面實驗

通過Plackett-Burman實驗[13]篩選出影響麻味物質(zhì)提取率的顯著性因素為：酶添加量、酶處理溫度和超聲功率。

a.單因素實驗

酶添加量：在酶處理溫度40 ℃，pH 4.8，酶處理時間3 h，超聲功率120 W，超聲時間30 min的條件下，考察酶添加量(2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%)對麻味物質(zhì)提取率的影響。

酶處理溫度：在酶添加量3.0%，pH 4.8，酶處理時間3 h，超聲功率120 W，超聲時間30 min的條件下，考察酶處理溫度(40，45，50，55，60 ℃)對麻味物質(zhì)提取率的影響。

超聲功率：在酶添加量3.0%，在酶處理溫度50 ℃，pH 4.8，酶處理時間3 h，超聲時間30 min的條件下，考察超聲功率(120，150，180，210，240，270，300 W)對麻味物質(zhì)提取率的影響。

b.Box-Behnken中心組合實驗優(yōu)化

在單因素實驗結(jié)果基礎(chǔ)上，根據(jù)Design-Expert 8軟件中Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計原理，以酶添加量、酶處理溫度和超聲功率為自變量，麻味物質(zhì)提取率為響應(yīng)值，在三因素三水平實驗上優(yōu)化得出工藝最佳參數(shù)[14]，因素水平設(shè)計見表2。

表2 響應(yīng)面實驗因素水平表Table 2 The factors and levels of response surface analysis design

1.2.3 掃描電鏡實驗

花椒樣品用2.5%戊二醛溶液固定靜置12 h，然后利用pH 6.8, 0.1 mol/mL的磷酸緩沖液沖洗3次，每次10 min，最后用不同溶度梯度(40%、60%、80%、90%、100%)的乙醇溶液對樣品進行脫水處理，每次10 min。再將脫水后的樣品進行臨界點干燥，然后用膠帶固定，并進行噴金處理，最后利用掃描電鏡進行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶混料設(shè)計實驗結(jié)果

由表3可知，使用果膠酶可以提高麻味物質(zhì)的提取率，而纖維素酶或半纖維素酶則無此現(xiàn)象，這可能與纖維素、半纖維素和果膠在花椒細胞中的組成有關(guān)。此外，纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶在麻味物質(zhì)提取中可能具有協(xié)同作用，與對照組和單一酶處理組相比，按一定比例復(fù)配的復(fù)合酶可顯著提高麻味物質(zhì)的提取率。纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶三者間配比與麻味物質(zhì)提取率間關(guān)系可用多項式方程進行擬合，表示為Y=10.07X1+9.43X2+10.68X3+0.032X1X2+6.44X1X3-0.27X2X3+81.90X1X2X3。

表3 混料設(shè)計實驗方案及結(jié)果Table 3 The experimental scheme and results of mixture design

由表4可知，該模型特征值中P>0.05，失擬項不顯著，且R2值為0.9405，說明此方程擬合有效，可對不同酶配比條件下麻味物質(zhì)提取率進行分析和預(yù)測。

表4 混料設(shè)計實驗結(jié)果統(tǒng)計學(xué)分析Table 4 The statistical analysis for the results of mixture design

由圖1可知，3種酶的配比對麻味物質(zhì)提取率有顯著影響，等高線越靠近中心其形狀越接近于橢圓，此時3種酶的交互作用顯著。因此,通過回歸方程得出復(fù)合酶的最佳配比為纖維素酶36.2%、半纖維素酶26.0%和果膠酶37.8%，此時預(yù)測麻味物質(zhì)提取率為13.94%。

圖1 復(fù)合酶交互作用對麻味物質(zhì)提取率影響的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.1 The contour plot and response surface plot of the effect of compound enzymes interaction on the extraction rates of numb-taste components

驗證實驗結(jié)果表明，麻味物質(zhì)提取率為(13.27±0.28)%，與回歸模型預(yù)測值無顯著差異。因此,纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶的最佳配比結(jié)果真實有效。

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果

2.2.1 單因素實驗結(jié)果

3個顯著性因素對麻味物質(zhì)提取率影響的單因素實驗結(jié)果見圖2。

圖2 酶添加量(a)、酶處理溫度(b)和超聲功率(c)對麻味物質(zhì)提取率的影響Fig.2 The effects of enzyme additive amount (a), enzyme treatment temperature (b) and ultrasonic power (c) on the extraction rates of numb-taste components

由圖2可知，3個因素的較優(yōu)參數(shù)分別為：酶添加量3.0%，酶處理溫度50 ℃，超聲功率210 W。

2.2.2 Box-Behnken中心組合實驗結(jié)果

運用Design-Expert 8軟件對實驗結(jié)果進行分析，得到因變量與自變量之間的二項式擬合方程：Y=15.64+0.28A+0.18B-0.06C-0.29AB+0.17BC- 0.76A2-1.10B2-0.50C2+0.49AB2-0.10B2C。進一步對回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表5。

表5 響應(yīng)面優(yōu)化實驗結(jié)果統(tǒng)計學(xué)分析Table 5 The statistical analysis for the results of response surface analysis design

由表5可知，二項式擬合模型具有極顯著性(P<0.0001)，模型修正系數(shù)R2=0.9942，說明該模型預(yù)測值與實驗的實際值擬合較好；失擬項P值為0.4237(P>0.05)，失擬項不顯著，表明方程模型誤差較小[15]。根據(jù)回歸分析結(jié)果，分別固定一個自變量的中間值，繪制因變量隨自變量變化的響應(yīng)曲面圖(見圖3)。發(fā)現(xiàn)酶添加量與酶處理溫度的交互作用較顯著，而酶添加量與超聲功率和酶處理溫度與超聲功率的交互作用不顯著。因此，對回歸模型進行優(yōu)化分析得到麻味物質(zhì)提取的最佳工藝參數(shù)為：酶添加量3.08%、酶處理溫度50.3 ℃和超聲功率208.5 W，此時麻味物質(zhì)的提取率為15.67%。

圖3 各因素交互作用對麻味物質(zhì)提取率影響的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.3 The contour plots and response surface plots of the effects of interactions of various factors on the extraction rates of numb-taste components注：A為酶添加量與酶處理溫度；B為酶處理溫度與超聲功率；C為酶添加量與超聲功率。

2.2.3 驗證實驗

在上述優(yōu)化的最佳工藝下進行驗證實驗，得出麻味物質(zhì)提取率為(15.14±0.54)%，與回歸模型預(yù)測值無顯著差異。因此該模擬結(jié)果真實有效，在此條件下花椒麻味物質(zhì)提取率從10.24%提升到15.14%。

2.3 掃描電鏡結(jié)果

2.3.1 不同酶處理后花椒細胞掃描電鏡結(jié)果

掃描電鏡圖(見圖4)顯示了未處理樣品和不同酶處理樣品的花椒細胞破碎情況。

圖4 不同酶處理后花椒細胞電鏡掃描圖Fig.4 The scanning electron microscopy of Zanthoxylum bungeanum cells treated with different enzymes注：A為對照組；B為纖維素酶組；C為半纖維素酶組；D為果膠酶組；E為復(fù)合酶組。

由圖4中A可知，未處理的花椒細胞中雖然出現(xiàn)大量皺縮情況，但是細胞結(jié)構(gòu)較為完整，無大量細胞壁破裂現(xiàn)象。而經(jīng)過纖維素酶(見圖4中B)、半纖維素酶(見圖4中C)、果膠酶(見圖4中D)和復(fù)合酶(見圖4中E)處理后的花椒細胞均出現(xiàn)大量細胞破裂現(xiàn)象，且細胞表面可見明顯破裂碎片。值得注意的是，復(fù)合酶處理后，花椒細胞破裂情況最為嚴重，細胞出現(xiàn)大量孔洞。因此表明與未處理組相比，使用酶處理均能破壞花椒的細胞結(jié)構(gòu)，并且纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶的混合使用可能具有協(xié)同作用，從而增強對花椒細胞結(jié)構(gòu)的破壞。

2.3.2 不同方法處理后花椒細胞掃描電鏡結(jié)果

掃描電鏡圖(見圖5)顯示了不同方法處理后花椒細胞破裂情況。

圖5 不同方法處理后花椒細胞電鏡掃描圖Fig.5 The scanning electron microscopy of Zanthoxylum bungeanum cells with different treatment methods注：A味精對照組；B為復(fù)合酶組；C為超聲組；D為復(fù)合酶與超聲組。

由圖5中A可知，未處理的花椒細胞中雖然出現(xiàn)大量皺縮情況，但是細胞結(jié)構(gòu)較為完整，無大量細胞壁破裂現(xiàn)象。復(fù)合酶處理后(見圖5中B)，花椒細胞結(jié)構(gòu)明顯被破壞，細胞壁出現(xiàn)不規(guī)則鋸齒狀邊緣，細胞空隙變大。超聲波處理后(見圖5 中C)，花椒細胞壁破裂，出現(xiàn)大量可見碎片，并且細胞間出現(xiàn)較大的撕裂斷痕。此外，經(jīng)過超聲波與復(fù)合酶共同處理的花椒細胞(見圖5中D)破壞最為嚴重，不僅細胞壁破裂形成小碎片，而且在細胞間還出現(xiàn)巨大破裂孔洞。因此，與未處理組相比，使用復(fù)合酶處理、超聲處理和超聲波與復(fù)合酶共同處理均能破壞花椒細胞結(jié)構(gòu)，并且超聲波與復(fù)合酶共同處理可能具有協(xié)同作用，從而增強對花椒細胞結(jié)構(gòu)的破壞。

3 結(jié)論

本文為提高傳統(tǒng)提取方式下花椒麻味物質(zhì)的提取率，采用超聲波協(xié)同復(fù)合酶處理提取花椒中的麻味物質(zhì)。通過混料設(shè)計、單因素實驗和Box-Behnken中心組合設(shè)計得到最佳的提取工藝條件：酶添加量3.08%，酶處理溫度50.3 ℃和超聲功率208.5 W。掃描電鏡實驗解釋了麻味物質(zhì)提取率提高的原因，超聲波協(xié)同復(fù)合酶處理可能存在協(xié)同作用，使花椒細胞結(jié)構(gòu)破壞得更加徹底，有利于麻味物質(zhì)溶出。因此，超聲波協(xié)同復(fù)合酶處理作為改進后的工藝，與傳統(tǒng)的提取工藝相比具有顯著的優(yōu)勢，有效地提高了花椒風味物質(zhì)的提取率，可為進一步開發(fā)和利用花椒中的麻味物質(zhì)提供理論依據(jù)。