董江鍇，杜金鳳，程天齡，黃迎燕，夏小凱，鄒勇，張?jiān)茲?，楊曉明?

1.上海捷諾生物科技有限公司，上海201700；2.長春生物制品研究所有限責(zé)任公司，吉林 長春130012；3.中國生物技術(shù)股份有限公司，北京100029；4.國家聯(lián)合疫苗工程技術(shù)研究中心武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，湖北武漢430207

自2019年12月以來，由2019新型冠狀病毒（2019 novel corona virus，2019-nCoV）感染引起的新型冠狀病毒肺炎迅速在全球暴發(fā)蔓延。2020年2月11日，世界衛(wèi)生組織代表在新型冠狀病毒全球研究與創(chuàng)新論壇上，將2019-nCoV正式命名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2），由SARS-CoV-2引起的新型冠狀病毒肺炎正式命名為COVID-19（coronavirus disease 2019）［1］。在我國，COVID-19作為急性呼吸道傳染病已納入《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定的乙類傳染病，按甲類傳染病管理［2］。SARSCoV-2屬于冠狀病毒β屬，其基因結(jié)構(gòu)特征與SARSCoV和中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）有明顯區(qū)別［3-4］。臨床上COVID-19以發(fā)熱、乏力、干咳為主要表現(xiàn)；胸部影像學(xué)以雙肺多發(fā)磨玻璃陰影為主要特征［5-6］。自該病暴發(fā)初期，國家衛(wèi)生健康委員會(huì)及時(shí)發(fā)布了《新型冠狀病毒肺炎診療方案》及《新型冠狀病毒感染的肺炎防控方案》，用于規(guī)范指導(dǎo)臨床和疾控機(jī)構(gòu)對(duì)COVID-19的診療，并隨著對(duì)病原及疾病認(rèn)識(shí)的不斷深入而不斷更新［7-8］。

在呼吸系統(tǒng)標(biāo)本中檢出SARS-CoV-2病原體是診斷COVID-19的金標(biāo)準(zhǔn)。國家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)指南》中，及時(shí)公布了基于熒光PCR法，檢測病毒核酸ORF1ab和N基因的引物和探針序列，指導(dǎo)生產(chǎn)企業(yè)用于SARS-CoV-2核酸檢測試劑的開發(fā)［9］。臨床上引起呼吸系統(tǒng)疾病的病原體非常復(fù)雜，可由單一病原體引起單純感染或多種病原體引起的混合感染，其臨床癥狀如發(fā)熱、乏力、干咳、鼻塞等非常相似［10］，干擾臨床精準(zhǔn)診斷和治療；此外，臨床用藥對(duì)部分輔助性檢測方法也會(huì)產(chǎn)生非特異性干擾，因此，樣本采集過程中必然受到各種內(nèi)源性和外源性干擾物質(zhì)的影響。鑒于COVID-19高傳染性的特點(diǎn)，臨床和疾控部門對(duì)COVID-19診斷篩查過程中核酸檢測試劑的高特異性要求顯得尤為重要。雖然目前可應(yīng)用于臨床診斷的核酸檢測方法和試劑不斷更新，但由于熒光PCR法便捷、敏感、穩(wěn)定，仍是應(yīng)用最廣泛的核酸檢測方法。上海捷諾生物科技有限公司生產(chǎn)的新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒（熒光PCR法），經(jīng)過不斷的條件優(yōu)化及各項(xiàng)性能驗(yàn)證，在臨床診斷、流行病學(xué)篩查、疾病預(yù)后等的應(yīng)用過程中，進(jìn)行了充分的數(shù)據(jù)檢驗(yàn)，本文對(duì)該公司連續(xù)生產(chǎn)的3批核酸檢測試劑盒的特異性進(jìn)行評(píng)估，以保證試劑盒在樣本存在干擾的情況下仍能準(zhǔn)確判定樣本。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 連續(xù)生產(chǎn)的3批新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒（熒光PCR法），批號(hào)：COV001NP、COV002NP和COV003NP，由上海捷諾生物科技有限公司生產(chǎn)；核酸提取試劑盒（貨號(hào)：52904）為德國QIAGEN公司產(chǎn)品；一次性使用病毒采樣管購自深圳梓健生物科技有限公司（粵深械備20190041號(hào)）；ABI7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 病毒及致病細(xì)菌核酸或病原體 地方性人冠狀病毒（HKU1、OC43、NL63和229E）核酸，SARS-CoV核酸，MERS-CoV核酸，HIN1［新型甲型H1N1流感病毒（2009）、季節(jié)性H1N1流感病毒］、H3N2、H5N1、H7N9病毒核酸，乙型流感Yamagata、Victoria，呼吸道合胞病毒A、B型病毒核酸，副流感病毒1、2、3型，鼻病毒A、B、C，腺病毒1、2、3、4、5、7、55型，腸病毒A、B、C、D，人間質(zhì)肺病毒，EB病毒核酸，麻疹病毒，人巨細(xì)胞病毒，輪狀病毒，諾如病毒，腮腺炎病毒，水痘-帶狀皰疹病毒，肺炎支原體，肺炎衣原體，軍團(tuán)菌，百日咳桿菌，流感嗜血桿菌，金黃色葡萄球菌，肺炎鏈球菌，化膿性鏈球菌，肺炎克雷伯菌，結(jié)核分枝桿菌，煙曲霉，白色念珠菌，光滑念珠菌，新生隱球菌，均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.3 人基因組DNA由上海捷諾生物科技有限公司在符合生物倫理要求情況下采集正常人口腔上皮脫落細(xì)胞制備并保存。

1.4 干擾物質(zhì) 按照國家食品藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心發(fā)布的《2019新型冠狀病毒核酸檢測試劑注冊(cè)技術(shù)審評(píng)要點(diǎn)》要求，選取人黏蛋白、血液（人）、苯福林、羥甲唑啉、氯化鈉（含防腐劑）、倍氯美松、地塞米松、氟尼縮松、曲安奈德、布地奈德、莫米松、氟替卡松、鹽酸組胺、ɑ-干擾素、扎那米韋、利巴韋林、奧司他韋、帕拉米韋、洛匹那韋、利托那韋、莫匹羅星、妥布霉素、左氧氟沙星、阿奇霉素、頭孢吡肟、米諾環(huán)素、阿比多爾、頭孢曲松和美羅培南為干擾物質(zhì)，均購自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源平臺(tái)。

1.5 陽性樣本核酸、臨界陽性樣本核酸及陰性樣本核酸 均來源于臨床試驗(yàn)過程中臨床診斷為COVID-19陽性和陰性患者鼻咽拭子提取物，樣本采集過程嚴(yán)格遵守臨床實(shí)驗(yàn)室關(guān)于SARS-CoV-2診斷安全防護(hù)要求，由上海捷諾生物科技有限公司保存。

1.6 驗(yàn)證方法

1.6.1 陽性樣本核酸、臨界陽性樣本核酸及陰性樣本核酸的提取 采用核酸提取試劑盒提取核酸，提取過程嚴(yán)格遵守臨床實(shí)驗(yàn)室關(guān)于SARS-CoV-2診斷安全防護(hù)要求。SARS-CoV-2核酸定量由生工生物工程（上海）股份有限公司采用微滴數(shù)字PCR法進(jìn)行，然后配制陽性核酸樣本為10 000 copies／mL，臨界陽性核酸樣本為600 copies／mL。

1.6.2 交叉反應(yīng)性驗(yàn)證 將以上病原體核酸分為18組，按不同病原體醫(yī)學(xué)相關(guān)水平（細(xì)菌感染濃度約106cfu／mL，病毒約105cfu／mL）分別加至陽性樣本核酸、陰性樣本核酸中，按照病原體組號(hào)，將混合陽性樣本命名為P1～P18，混合陰性樣本命名為N1～N18，同時(shí)設(shè)陽性和陰性空白對(duì)照（P0和N0）。使用3批（COV001NP、COV002NP和COV003NP）試劑盒，每份樣本重復(fù)3次，記錄Ct值。代表相應(yīng)核酸的呼吸道病原體分組見表1。

1.6.3 抗干擾物質(zhì)驗(yàn)證 將以下29種干擾物質(zhì)按臨床常見最高濃度加至陽性樣本（分別命名為P1～P29）、臨界陽性樣本（分別命名為LP1～LP29）、陰性樣本（分別命名為N1～N29），設(shè)陽性、臨界陽性及陰性空白對(duì)照（分別命名為P0、LP0和N0）。使用3批試劑盒（COV001NP、COV002NP和COV003NP），每份樣本重復(fù)3次，記錄Ct值。干擾物質(zhì)及使用濃度見表2。

1.6.4 檢測方法及判定標(biāo)準(zhǔn) 樣品檢測方法嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。每個(gè)反應(yīng)程序設(shè)陰性質(zhì)控、陽性質(zhì)控及內(nèi)控各3孔。PCR反應(yīng)體系25μL。PCR反應(yīng)條件：逆轉(zhuǎn)錄50℃5 min；預(yù)變性95℃20 s；95℃10 s，57℃60 s，共45個(gè)循環(huán)。ORF1ab／N Ct值＜37為陽性，ORF1ab／N Ct值≥37為陰性。

表1 呼吸道常見病原體分組Tab.1 Grouping of common pathogens of respiratory tract

表2 干擾物質(zhì)及使用濃度Tab.2 Concentration of interfering substances

2 結(jié)果

2.1 交叉反應(yīng)性3批試劑盒檢測結(jié)果顯示，P0～P 18檢測結(jié)果均為陽性，見表3，N0～N18檢測結(jié)果均為陰性。表明以上交叉反應(yīng)物質(zhì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無影響。

2.2 抗干擾性能3批試劑盒檢測結(jié)果顯示，P0～P29、LP0～LP29檢測結(jié)果均為陽性，見表4和表5，N0～N29檢測結(jié)果均為陰性。表明29種內(nèi)源／外源干擾物質(zhì)對(duì)3批試劑盒的檢測結(jié)果無影響。

表3 COV001NP、COV002NP、COV003NP批試劑盒檢測混合陽性樣本ORF1ab／N Ct值（，n=3）Tab.3 Test results of ORF1ab／N Ct of mixed positive samples by detection kits of Lots COV001NP，COV002NP and COV003NP（，n=3）

表3 COV001NP、COV002NP、COV003NP批試劑盒檢測混合陽性樣本ORF1ab／N Ct值（，n=3）Tab.3 Test results of ORF1ab／N Ct of mixed positive samples by detection kits of Lots COV001NP，COV002NP and COV003NP（，n=3）

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表4 COV001NP、COV002NP、COV003NP批試劑盒檢測陽性樣本ORF1ab／N Ct值（，n=3）Tab.4 Test results of ORF1ab／N Ct of positive samples by detection kits of Lots COV001NP，COV002NP and COV003NP（，n=3）

表4 COV001NP、COV002NP、COV003NP批試劑盒檢測陽性樣本ORF1ab／N Ct值（，n=3）Tab.4 Test results of ORF1ab／N Ct of positive samples by detection kits of Lots COV001NP，COV002NP and COV003NP（，n=3）

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表5 COV001NP、COV002NP、COV003NP批試劑盒檢測臨界陽性樣本ORF1ab／N Ct值（，n=3）Tab.5 Test results of ORF1ab／N Ct of borderline positive samples by detection kits of Lots COV001NP，COV002NP and COV-003NP（，n=3）

表5 COV001NP、COV002NP、COV003NP批試劑盒檢測臨界陽性樣本ORF1ab／N Ct值（，n=3）Tab.5 Test results of ORF1ab／N Ct of borderline positive samples by detection kits of Lots COV001NP，COV002NP and COV-003NP（，n=3）

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3 討論

自COVID-19暴發(fā)以來，作為疾病診斷金標(biāo)準(zhǔn)的核酸定性檢測熒光PCR法快速研發(fā)上市，成為臨床確診篩查的主要手段。熒光PCR法因其敏感度高，特異性強(qiáng)，已被廣泛應(yīng)用于疾病診斷、鑒別診斷、療效評(píng)估及流行病學(xué)調(diào)查，是臨床微生物檢測最常用的分子生物學(xué)檢測手段［11-12］。在呼吸系統(tǒng)感染疾病診斷中，由于感染病原微生物復(fù)雜程度高，且熒光PCR法高敏感性的特點(diǎn)，使病原核酸檢測過程和結(jié)果極易受到污染及干擾，新建立的核酸檢測方法以及試劑的檢測特異性和良好的抗干擾能力是適用于臨床應(yīng)用的前提。

本研究參考《2019新型冠狀病毒核酸檢測試劑注冊(cè)技術(shù)審評(píng)要點(diǎn)》對(duì)地方性人冠狀病毒、呼吸道常見病毒及病原菌等55種病原體，在其感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行了系統(tǒng)的交叉反應(yīng)驗(yàn)證［13］。將病原體交叉分組，分別加至陽性樣本和陰性樣本并設(shè)置人管家基因基因組交叉樣本。檢測結(jié)果顯示，連續(xù)生產(chǎn)的3批新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒（熒光PCR法），混合陽性樣本及混合陰性樣本特異性檢測具有良好的穩(wěn)定性。在抗干擾物質(zhì)驗(yàn)證中，針對(duì)檢測過程中可能存在的干擾情況，分別進(jìn)行了每種干擾物質(zhì)臨床潛在最大濃度對(duì)陽性及臨界陽性水平的陽性對(duì)照的干擾試驗(yàn)驗(yàn)證，干擾物質(zhì)涵蓋了樣本采集過程中人自身樣本污染物及27種臨床常用抗病毒藥物、抗菌藥物及疾病治療過程中可能用到的抗過敏等內(nèi)用或外用藥物。檢測結(jié)果顯示，連續(xù)生產(chǎn)的3批新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）檢測陽性、臨界陽性、陰性樣品，具有較高的抗干擾能力和檢測穩(wěn)定性。以上結(jié)果表明，該試劑盒符合臨床特異性檢測要求［13］。

熒光PCR法核酸檢測靈敏度高，檢測結(jié)果易受多種內(nèi)源及外源因素的影響。對(duì)于COVID-19的診斷，早期樣本采集主要集中在呼吸系統(tǒng)樣本，包括鼻咽拭子、呼吸道分泌物等，對(duì)于特殊病例，患者肛拭子等其他樣本也檢出SARS-CoV-2，因此除呼吸系統(tǒng)病原存在交叉污染的可能外，還存在多種其他已知病原體交叉污染的可能［14］。除SARS-CoV-2外，目前已發(fā)現(xiàn)可感染人類的冠狀病毒還有6種，它們之間病毒基因結(jié)構(gòu)差別不大，有些常見病毒雖不引起嚴(yán)重肺炎性疾病，但對(duì)核酸檢測會(huì)造成干擾。另外，呼吸系統(tǒng)感染引起早期臨床癥狀的相似性也是誤導(dǎo)COVID-19臨床診斷的影響因素之一［15-16］。因此，對(duì)核酸檢測試劑交叉反應(yīng)性評(píng)價(jià)是方法學(xué)建立和臨床應(yīng)用的前提。本研究使用連續(xù)生產(chǎn)的3批新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒（熒光PCR法），系統(tǒng)評(píng)估了方法的檢測特異性。驗(yàn)證設(shè)計(jì)全面考慮了臨床采樣、臨床用藥及潛在交叉污染的微生物病原體的干擾，保證了COVID-19臨床精準(zhǔn)診斷的特異性，并為熒光PCR法核酸檢測試劑的開發(fā)提供了設(shè)計(jì)思路。