富國文，敖平星，單春蘭，趙 汝，劉超英，高 洪

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201)

耶爾森菌強(qiáng)毒力島(The Yersinia High-pathogeniticity island，HPI)首先發(fā)現(xiàn)于鼠疫耶爾森氏菌，為其毒力表型所必需，含有與攝鐵有關(guān)的毒力基因簇[1-2]。進(jìn)一步的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，HPI不僅存在于耶爾森氏菌，在其他桿菌中也廣泛存在，如致病性大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)、枸櫞酸桿菌、沙門菌、克雷伯菌等，是一個重要的毒力因子[3-5]。irp2是HPI的主要功能基因，近年來一些研究從不同的角度證實了irp2在E.coli致病中的作用，但其致病機(jī)制仍未完全明確[6-8]，因此，irp2基因缺失株的構(gòu)建對其致病機(jī)制的研究至關(guān)重要。Red同源重組是E.coli基因敲除的常用方法，分別攜帶氨芐青霉素抗性、卡那霉素抗性和氯霉素抗性的pKD46、pKD3/4和pCP20是常用的工程質(zhì)粒[7-9]。要利用上述抗性進(jìn)行篩選，就要求試驗菌株對這些抗生素具有敏感性。由于抗生素在養(yǎng)殖生產(chǎn)中的廣泛使用，很多臨床分離菌株對其中的一種或多種抗生素不敏感，給篩選帶來困難。E.coliA/10是一株分離自腹瀉撒壩仔豬糞便的致病性大腸埃希菌，耐藥性檢測表明該菌對氨芐青霉素、氯霉素、慶大霉素、土霉素和壯觀霉素不敏感，對卡那霉素和博來霉素敏感。我們期望在Red同源重組方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，實現(xiàn)該多耐藥菌株的irp2基因缺失。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒E.coliA/10菌株分離自腹瀉撒壩仔豬糞便，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物病理學(xué)實驗室鑒定，并證實該菌株具有致病性；大腸埃希菌DH5α由本實驗室保存。pPICZαA質(zhì)粒(含博來霉素抗性)和pCas(含卡那霉素抗性)由西北農(nóng)林科技大學(xué)杜恩歧副教授饋贈，pCP20質(zhì)粒購自淼靈生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 2×Easy TaqPCR Super Mix、DNAMarker，北京百泰克生物有限公司；ApaⅠ、BglII、T4連接酶、核酸染料、瓊脂糖、50×TAE，寶生物(大連)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA回收試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；博萊霉素、卡那霉素，Gibco公司，使用濃度分別為25 mg/L和50 mg/L；LB培養(yǎng)基，廣州環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 電穿孔儀(GenePulser Xcell)、PCR儀，伯樂公司；FA1004N電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；YXQ-SG46-280不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DYCP-31BN電泳儀，北京六一儀器廠；WD-9403F凝膠成像儀，北京六一儀器廠；高速冷凍離心機(jī)，美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.1.4 引物設(shè)計 根據(jù)本實驗室已測序的E.coliA/10菌株irp2基因序列設(shè)計打靶片段引物arm-F和arm-R(包含同源臂、FRT位點(diǎn)和博來霉素抗性引物)；以pCP20質(zhì)粒為模板，設(shè)計引物FLP-F和FLP-R(分別攜帶ApaⅠ和BglII酶切位點(diǎn))擴(kuò)增FLP酶；以pCas質(zhì)粒序列為模板，設(shè)計鑒定引物pCas-JD-F和pCas-JD-R；以pCP20序列為模板，設(shè)計FLP酶鑒定引物FLP-JD-F和FLP-JD-R；以E.coliA/10菌株irp2基因上下游序列為模板設(shè)計irp2基因缺失鑒定引物Δirp2-F和Δirp2-R。引物由昆明擎科生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物

1.2 方法

1.2.1 打靶片段擴(kuò)增與重組質(zhì)粒構(gòu)建 以arm-F、arm-R為引物，以pPICZαA質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增打靶片段。PCR反應(yīng)體系為25 μL：模板DNA 1 μL，上、下游引物各 0. 5 μL，TaqPCR Super Mix為12.5 μL，ddH2O 10.5 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，回收，命名為arm，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以FLP-F、FLP-R為引物，以pCP20質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增FLP片段。PCR反應(yīng)體系同上, 退火溫度56 ℃，產(chǎn)物命名為FLP。利用ApaⅠ和BglII酶分別對擴(kuò)增的FLP片段和pCas質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。酶切體系：ApaⅠ酶1 μL，BglII酶1 μL，pCas質(zhì)粒/FLP片段18 μL，Buffer 5 μL，純水25 μL，混勻，37 ℃水浴2 h。DNA回收試劑盒回收產(chǎn)物，純水20 μL溶解待用。上述酶切產(chǎn)物，以T4連接酶進(jìn)行連接。酶連接體系：T4連接酶5 μL，pCas質(zhì)粒酶切產(chǎn)物1 μL，F(xiàn)LP酶切產(chǎn)物4 μL，16 ℃水浴1 h，DNA回收試劑盒回收產(chǎn)物，純水20 μL溶解待用。將上述產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，方法參見文獻(xiàn)[10]，接種于含有50 mg/L卡那霉素的LB平板，30 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落，以FLP-JD-F、FLP-JD-R為引物進(jìn)行鑒定，PCR反應(yīng)體系同上。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。將鑒定為FLP陽性的克隆菌接種于LB液體培養(yǎng)基中30 ℃過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，命名為pCas-FLP，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 pCas介導(dǎo)的irp2基因缺失 以E.coliA/10制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞，方法參見文獻(xiàn)[10]。將pCas電轉(zhuǎn)化E.coliA/10感受態(tài)細(xì)胞，接種于含有50 mg/L卡那霉素的LB平板，30 ℃過夜培養(yǎng)，陽性克隆以pCas-JD-F和pCas-JD-R為引物進(jìn)行鑒定。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s， 30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。將pCas質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功的菌株接種于含50 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600為0.2時，向搖瓶中加入終濃度為10 mmol/L的阿拉伯糖誘導(dǎo)pCas載體上λ-Red蛋白表達(dá)，繼續(xù)搖至OD600為0.5時回收菌體，同上方法制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞。將arm電轉(zhuǎn)化到含pCas的E.coliA/10感受態(tài)細(xì)胞中，于含25 mg/L博萊霉素和50 mg/L卡那霉素的LB雙抗固體培養(yǎng)基上30 ℃過夜培養(yǎng)。挑取陽性轉(zhuǎn)化子，接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)，取50 μL菌液用LB液體培養(yǎng)基10倍稀釋后涂布于含25 mg/L博萊霉素的LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落，接種于含有50 mg/L卡那霉素的液體LB中，不能生長表明pCas質(zhì)粒被消除。

以上述消除pCas質(zhì)粒的單克隆菌株制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞，方法參見文獻(xiàn)[10]，電轉(zhuǎn)入pCas-FLP重組質(zhì)粒，于含50 mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上30 ℃過夜培養(yǎng)。挑取陽性克隆菌，接種于含有25 mg/L博萊霉素的LB平板，30 ℃過夜培養(yǎng)，不能生長表明打靶片段被去除。同pCas消除步驟消除pCas-FLP重組質(zhì)粒，獲得目的重組菌，以Δirp2-JD-F和Δirp2-JD-R為引物進(jìn)行鑒定。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，回收后送昆明擎科生物科技有限公司測序，正確的菌株命名為Δirp2-E.coliA/10。

1.2.3 生長曲線測定 挑取E.coliA/10與 Δirp2-E.coliA/10菌株單克隆接種于LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，調(diào)整吸光度為OD600≈0.5，分別按1∶100的比例接入20 mL的LB培養(yǎng)基中，調(diào)OD600≈0.01，150 r/min，37 ℃振蕩培養(yǎng)，每隔1 h測定OD600，每個時間點(diǎn)測3個重復(fù)，繪制生長曲線。

2 結(jié) 果

2.1 打靶片段擴(kuò)增與重組質(zhì)粒構(gòu)建

本試驗中用于敲除irp2基因的打靶片段由位于兩側(cè)的同源臂、FRT位點(diǎn)和中間的博萊霉素抗性基因組成，大小為840 bp。PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，與目的片段大小基本一致(圖1A)。

以FLP-F 和FLP-R為上下游引物擴(kuò)增FLP酶序列，兩端分別攜帶ApaⅠ和BglⅡ酶切位點(diǎn)，大小應(yīng)為2 262 bp。PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，與目的片段大小基本一致(圖1B)。FLP片段和pCas質(zhì)粒經(jīng)ApaⅠ和BglⅡ酶切后以T4連接酶連接，電轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，于含有50 mg/L卡那霉素的LB平板上長出單克隆菌落。隨機(jī)挑選單克隆菌，以pCas-JD-F和pCas-JD-R為引物進(jìn)行PCR檢測，擴(kuò)增到清晰條帶，大小為450 bp左右，與目的條帶大小基本一致(圖1C)，表明pCas-FLP重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 打靶片段擴(kuò)增與重組質(zhì)粒構(gòu)建過程中的PCR產(chǎn)物

2.2 pCas介導(dǎo)的irp2基因缺失

轉(zhuǎn)入pCas質(zhì)粒后的E.coliA/10陽性轉(zhuǎn)化子，以pCas-JD-F和pCas-JD-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物大小340 bp左右，與目的條帶大小基本一致(圖2 A)，表明pCas質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功。繼續(xù)電轉(zhuǎn)入打靶片段后，在含有卡那霉素和博來霉素的LB平板上有單克隆菌長出，提示打靶片段整合到E.coliA/10基因組。在37 ℃的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后，篩選得到pCas質(zhì)粒被消除的單克隆菌。

上述消除pCas質(zhì)粒的單克隆菌電轉(zhuǎn)pCas-FLP后，在卡那霉素平板上長出單克隆菌。隨機(jī)挑取的單克隆菌在博萊霉素平板上不能生長，提示打靶片段被消除。經(jīng)37 ℃培養(yǎng)后，獲得了不能在卡那霉素平板上生長的單克隆，提示pCas-FLP質(zhì)粒被消除。以位于同源臂上下游的Δirp2-JD-F和Δirp2-JD-R引物對消除pCas-FLP質(zhì)粒的單克隆菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物大小369 bp左右，符合預(yù)期(圖2B)。目的條帶測序結(jié)果證實irp2基因5 990 bp被刪除，一個FRT位點(diǎn)被保留，表明irp2基因缺失菌株構(gòu)建成功，獲得目的菌Δirp2-E.coliA/10。

圖2 pCas鑒定與E.coli A/10 irp2基因缺失鑒定的PCR產(chǎn)物

2.3 irp2基因缺失對菌株生長的影響

E.coliA/10和Δirp2-E.coliA/10菌株在37 ℃、150 r/ min的LB液體培養(yǎng)基中的生長曲線見圖3。親本株與缺失株在各測試點(diǎn)生長速率差異不顯著(P>0.05)，表明irp2基因缺失對該菌株在LB培養(yǎng)基中的增殖沒有顯著影響。

圖3 E. coli A/10與E. coli Δirp2-A/10菌株生長曲線

3 討 論

隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的細(xì)菌基因組序列被公布，大量的分子生物學(xué)信息被獲得，然而對基因功能的了解卻很有限，而基因編輯提供了一種了解單個基因功能的途徑。從20世紀(jì)80年代基因敲除首次被報道，至今已涌現(xiàn)出多種不同的基因編輯技術(shù)，廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、食品發(fā)酵工程等多個領(lǐng)域[9,11]。1998年，Murphy利用噬菌體Red同源重組系統(tǒng)對大腸埃希菌中進(jìn)行了基因編輯，通過克隆到質(zhì)粒上的exo、beta、gam基因協(xié)同作用，促進(jìn)同源重組的發(fā)生，大大提高了重組效率，使其廣泛應(yīng)用于E.coli的基因編輯[12-14]。

隨著各種抗生素及化學(xué)合成藥物在養(yǎng)殖生產(chǎn)中的廣泛使用，養(yǎng)殖環(huán)境中細(xì)菌的耐藥譜不斷擴(kuò)大，耐藥水平不斷提升，導(dǎo)致我們對臨床分離菌株進(jìn)行基因編輯時可使用的篩選標(biāo)記越來越少[15]。在本試驗中，分離自腹瀉撒壩仔豬糞便的E.coliA/10對氨芐青霉素、氯霉素、慶大霉素、土霉素和壯觀霉素等抗生素不敏感，使得經(jīng)常用于E.coli的Red同源重組質(zhì)粒難以實現(xiàn)對該菌株的基因編輯，促使我們探索新的策略。首先以攜帶卡那霉素抗性的pCas質(zhì)粒代替pKD46質(zhì)粒，因為E.coliA/10對卡那霉素敏感，而該質(zhì)粒上攜帶的exo、beta、gam為Red同源重組所必須。理論上，此處對pKD46質(zhì)粒進(jìn)行改造，將氨芐青霉素抗性替換為卡那霉素抗性應(yīng)該也是可行的，但需要增加操作環(huán)節(jié)。其次，因為該菌株對博萊霉素敏感，便于篩選，故以含有博來霉素抗性的pPICZαA質(zhì)粒為模板擴(kuò)增打靶片段。

位點(diǎn)特異性重組(site-specific recombination)技術(shù)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一項重要分子生物學(xué)技術(shù)，可通過特異性位點(diǎn)重組酶，在基因組和外源DNA上進(jìn)行基因操作，實現(xiàn)基因置換、倒置和敲除[16-17]。 Cre/loxp、 FLP/FRT和ΦC31-Int是當(dāng)前研究和應(yīng)用最多的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)。來源于酵母的 FLP/FRT位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)由于具有較高的重組效率和靶向性，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、HIV病毒等微生物的基因編輯[18]。在利用Red同源重組進(jìn)行E.coli基因編輯時，該系統(tǒng)主要用于打靶片段的消除。在進(jìn)行打靶片段擴(kuò)增時，將34 bp的FRT位點(diǎn)插入同源臂與抗性基因引物序列之間，需要注意的是，兩側(cè)的FRT位點(diǎn)方向要相同，此時兩FRT位點(diǎn)之間的基因被刪除[19]。在FLP/FRT系統(tǒng)介導(dǎo)的重組反應(yīng)中，F(xiàn)LP 重組酶是除重組位點(diǎn)外唯一的必需因子?？杀磉_(dá)FLP重組酶的pCP20是應(yīng)用該系統(tǒng)進(jìn)行E.coli基因編輯時常用的質(zhì)粒，通常攜帶氯霉素和氨芐青霉素抗性。由于E.coliA/10對氯霉素和氨芐青霉素不敏感，難以進(jìn)行篩選，本研究中將pCP20質(zhì)粒中的氯霉素抗性替換為卡那霉素抗性，未能實現(xiàn)對打靶片段的消除，推測可能是由于該質(zhì)粒中還含有氨芐青霉素抗性基因，而E.coliA/10具有氨芐青霉素抗性，影響到該質(zhì)粒的表達(dá)，其確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。之后，我們嘗試將pCP20質(zhì)粒中的flp基因克隆出來并連接到pCas質(zhì)粒，通過pCas質(zhì)粒來表達(dá)FLP重組酶，成功實現(xiàn)了對打靶片段的消除。生長曲線測定結(jié)果表明，在LB培養(yǎng)基中irp2基因缺失對菌株的生長無顯著影響，這可能與大腸埃希菌還有其他獲取鐵的方式有關(guān)，如腸菌素、沙門菌素、氣桿菌素等[20-21]。

4 結(jié) 論

本研究以Red同源重組的方法為基礎(chǔ)，根據(jù)菌株的耐藥特點(diǎn)構(gòu)建針對性的重組質(zhì)粒，成功實現(xiàn)了對E.coliA/10的基因敲除，為多耐藥E.coli的基因編輯提供了一種新的方法。