張俊杰，吉萬全，張耀元，張 宏，陳春環(huán)

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

小麥?zhǔn)鞘澜缟现匾募Z食作物之一[1]，但小麥植株過高容易倒伏，進(jìn)而滋生病蟲害，影響小麥生長，導(dǎo)致小麥籽粒灌漿不足，產(chǎn)量降低[2]。因此，選育矮稈抗倒伏小麥品種對提高小麥產(chǎn)量具有重要意義。

迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)24個(gè)控制小麥矮稈性狀的基因，在已知的小麥矮稈基因家族中，最受關(guān)注且應(yīng)用最廣泛的基因是Rht1、Rht2和Rht8[3-4]，世界上超過半數(shù)的矮稈小麥品種都帶有Rht1和Rht2這兩個(gè)矮稈基因[5-7]。Rht1、Rht2、Rht3和Rht10基因已成功被克隆[8-9]，其他20個(gè)Rht基因也在育種中得到不同程度地利用[1，10-11]。其中Rht9基因在育種中應(yīng)用規(guī)模較小[12]；Rht4、Rht5、Rht6、Rht7等基因雖然能夠顯著降低小麥植株高度，但會(huì)導(dǎo)致小麥產(chǎn)量大幅度降低，不利于實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用[13-14]。Goudia等[15]通過生物技術(shù)手段對Rht5基因進(jìn)行優(yōu)化改造，使Rht5基因的應(yīng)用潛力得到提升。Li等[16]發(fā)現(xiàn)，Rht11基因只在歐洲小麥育種中被廣泛利用。目前在小麥基因家族中，Rht24基因廣泛分布于全球各個(gè)地區(qū)，在世界各地的小麥育種中都有利用[17]。

隨著現(xiàn)代分子技術(shù)的快速發(fā)展以及測序成本顯著下降，BSR-Seq技術(shù)成為植物目標(biāo)性狀基因定位的主要手段，如玉米蠟質(zhì)調(diào)控基因gl3[18]、根毛生長調(diào)控基因Rht5[19]、葉脈發(fā)育調(diào)控基因bm2[20]、小麥的黃銹病抗性基因Yr15[21]、高谷蛋白含量基因GPC-B1[22]、洋蔥的雄性不育育性恢復(fù)候補(bǔ)基因AcPMS1[23]、蘿卜的育性恢復(fù)基因Rfd1[24]等均采用此方法進(jìn)行定位。

近等基因系(near-isogenic line ,NIL)是指通過親本之間的反復(fù)雜交獲得的遺傳背景相同而個(gè)體特征不同的種系。因此，近等基因系可以快速、準(zhǔn)確地定位到目標(biāo)性狀QTL[25-26]。剩余雜合體(residual heterozygous line,RHL)相當(dāng)于近等基因系材料配對雜交產(chǎn)生的F1,收獲自交種子得到在目標(biāo)區(qū)間呈雜合型、而其余區(qū)間均為純合型的遺傳材料。因此，從某種意義上說，剩余雜合體就是近等基因系的一個(gè)擴(kuò)展[27]。

本研究以小麥品種品冬34和Warran雜交構(gòu)建的重組自交系(recombinant inbred lines,RIL)群體為材料，于F7:8代篩選出一個(gè)株高性狀分離的剩余雜合體，并利用BSR-seq技術(shù)對該剩余雜合體分離出的高株與矮株純系分別混池測序，進(jìn)行株高基因位點(diǎn)的初步定位，并對預(yù)測區(qū)段內(nèi)候選基因進(jìn)行功能預(yù)測，以期為今后開展小麥株高基因挖掘與功能分析以及小麥矮稈品種的選育奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)室前期以矮稈小麥品種品冬34為母本，以高稈小麥品種Warran為父本雜交構(gòu)建了RIL群體。品冬34是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物品種資源研究所選育品種，具有矮稈、千粒重高等優(yōu)良品質(zhì)。Warran是國外引進(jìn)的小麥種質(zhì)資源，具有高稈、千粒重低的特征。從該RIL群體F7:8代中篩選到一對株高分離的剩余雜合體，并獲得高株和矮株純系(命名為658高/矮近等基因系，即658 H/D NILs)，分別于2017-2018、2018-2019和2019-2020年度種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)小麥試驗(yàn)基地，行距24 cm，株距10 cm，每行10株，658 H/D NILs親本各4行。其中，2018-2019年度，658高株和矮株NILs純系雜交得到F1代，2019-2020年度，F(xiàn)1自交得到F2分離群體。

1.2 樣品取樣與BSR測序

于小麥起身期、拔節(jié)期和抽穗期，分別在658高株和658矮株NILs主莖的各節(jié)間取樣，長度約為1.00 cm，液氮冷凍，-80 ℃保存待用。分別將658高株和658矮株NILs不同時(shí)期與不同節(jié)間樣品混合，送北京諾禾生物技術(shù)有限公司進(jìn)行RNA提取和BSR-seq測序分析。

1.3 候選基因篩選與功能分析

利用KEGG(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)查閱代謝通路，利用URGI(https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/)注釋小麥候選基因，利用小麥多組學(xué)(Triticeae Multi-omics Center)網(wǎng)站(http://202.194.139.32/)進(jìn)行小麥組織特異性表達(dá)預(yù)測。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用R語言進(jìn)行基因初步定位與Manhattan制作，利用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 658 H/D NILs的表型鑒定結(jié)果

如表1所示，658 H/D NILs在三個(gè)種植季的穗長、小穗數(shù)、千粒重表型數(shù)據(jù)除在2018年千粒重存在顯著差異外，其余均無顯著差異；采用 1 000對SSR標(biāo)記對658 H/D NILs材料進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果均無差異(結(jié)果未列出)，結(jié)果表明，658高株與658矮株材料遺傳背景相似。在每個(gè)種植季，658高株的株高均比同一環(huán)境下的658矮株高，且658高株與658矮株間的株高差異極顯著(P=0.000 532<0.01)。綜上所述，658 H/D NILs材料可以用于株高的BSR-Seq分析。

表1 658 H/D NILs的田間表型數(shù)據(jù)Table 1 Field phenotypic data of 658 H/D NILs in different years

2.2 658 H/D NILs遺傳群體的表型分析結(jié)果

658 H/D NILs雜交F1代的株高更趨向于658高株，表明高稈性狀由顯性基因控制。658 H/D NILs F2群體的株高頻率呈正態(tài)分布(圖1)，預(yù)測其株高性狀由多基因控制。658 H/D NILs F2群體的株高基因型模型以卡方值(χ2)最小和可信度(P值)最大為最優(yōu)模型，由表2可知，模型M3為F2群體最優(yōu)分離模型，株高比例符合9∶7，卡方值和可信度分別為0.07和0.78(P> 0.05)，表明658 H/D NILs的株高可能由兩對顯性互補(bǔ)基因控制。

2.3 658 H/D NILs株高基因的定位結(jié)果

通過BSR-seq分析，將658 H/D NILs的株高基因定位于7B染色體687～689 Mb處(圖2)。根據(jù)BSR測序結(jié)果進(jìn)行差異SNP富集分析，共篩選到979個(gè)SNP位點(diǎn)(ED=2)(圖3)，其中，7B染色體上的SNP位點(diǎn)數(shù)最多，為111個(gè)，在688 Mb處富集的SNP位點(diǎn)最多，為22個(gè)；3B染色體上的SNP位點(diǎn)數(shù)次之，為96個(gè)。其余染色體的差異SNP位點(diǎn)富集不明顯。綜合以上BSR-seq分析，初步預(yù)測658 H/D NILs的株高基因位于7B染色體687～689 Mb處。

2.4 BSR-seq候選基因的分析結(jié)果

通過與中國春小麥參考基因組比對，658 H/D NILs 7B染色體687～689 Mb處共有18個(gè)候選基因(表3)，其中，8個(gè)基因參與相關(guān)通路表達(dá)，TraesCS7B02G419700參與糖類代謝途徑，主要完成D1磷酸葡萄糖與UDP葡萄糖之間的轉(zhuǎn)化；TraesCS7B02G419500參與甘油脂類代謝通路，主要在3-磷酸甘油酸?；D(zhuǎn)移酶通路中起作用；TraesCS7B02G419800、TraesCS7B02G419900、TraesCS7B02G420100、TraesCS7B02G420400、TraesCS7B02G420500和 TraesCS7B02G420600在溶酶體Pro-X 羧肽酶通路中參與調(diào)控。

圖1 658 H/D NILs F2群體株高表型 的頻率分布和正態(tài)分布情況Fig.1 Phenotypic frequency and normal distribution of plant height in F2 populations of 658 H/D NILs

表2 658 H/D NILs F2群體株高基因型模型分析Table 2 Model analysis of F2 populations of 658 H/D NIL by chi-square test

Manhattan圖表示每條染色體上多態(tài)性SNP數(shù)目占總SNP數(shù)目的比例。在染色體上通過連續(xù)滑窗方式每10個(gè)ED值進(jìn)行均值 計(jì)算。

圖3 BSR-seq所有SNP(ED=2)在21條染色體上的分布Fig.3 Distribution of all SNP(ED=2) from BSR-seq results on 21 chromosomes

通過小麥組織特異性表達(dá)預(yù)測分析，18個(gè)候選基因中共有6個(gè)基因在莖中表達(dá)，其中TraesCS7B02G420400在莖中相對表達(dá)量最高。預(yù)測區(qū)間內(nèi)的18個(gè)候選基因中，TraesCS7B02 G419700和TraesCS7B02G420400參與小麥代謝通路和莖的生長發(fā)育；而TraesCS7B02G418900、TraesCS7B02G419000、TraesCS7B02G419600和TraesCS7B02G420000只參與莖的生長發(fā)育。

表3 658 H/D NILs株高相關(guān)候選基因的信息Table 3 Annotation of candidate genes in 658 H/D NILs by mapping to the Chinese Spring wheat genome

3 討 論

658 H/D NILs遺傳背景相似、只有株高差異顯著，通過R語言進(jìn)行BSR-seq分析，初步預(yù)測658 H/D NILs株高基因位于7B染色體687～689 Mb處。在已經(jīng)公布的24個(gè)矮稈基因中，Rht9與Rht13這兩個(gè)矮稈基因均位于7B染色體上[28-29]，目前尚未克隆，利用與Rht9和Rht13基因緊密連鎖的標(biāo)記，在658 H/D NILs中進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)并不含Rht9和Rht13，表明控制658剩余雜合體株高的基因與已經(jīng)公布的24個(gè)矮稈基因并不相同。胡文靜等[30-31]、李 聰?shù)萚32]和孫陽陽等[33]等分別定位到8、3和5個(gè)控制株高的QTL，分布在2B、2D、4B、4D、5A、5B和7A染色體上。武炳瑾等[34]等共檢測到9個(gè)控制株高的QTL，除了以上7條染色體外，在7B染色體23～33 cM處也定位到控制株高的QTL。因此，本研究株高定位結(jié)果與前人檢測的控制株高QTL位點(diǎn)均不一致，可能為新的控制株高的位點(diǎn)。

658 H/D NILs在7B染色體687～689 Mb處共有18個(gè)候選基因，有2個(gè)候選基因參與代謝過程和小麥莖的生長發(fā)育，其中，TraesCS7B02- G420400在莖中的相對表達(dá)量較高，可以優(yōu)先考慮進(jìn)一步研究；4個(gè)候選基因不參與代謝過程，但在小麥莖中表達(dá)，這4個(gè)候選基因?qū)π←湴捇蛲诰蛞约肮δ茯?yàn)證方面具有重要意義，特別是TraesCS7B02G419000。經(jīng)分離模型預(yù)測分析，658 H/D NILs的株高性狀由兩個(gè)顯性互補(bǔ)基因控制，推測這6個(gè)候選基因中包含這兩個(gè)顯性互補(bǔ)株高基因，但還需進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究利用BSR-seq技術(shù)，在658 H/D NILs中進(jìn)行株高基因初步定位與候選基因功能分析，為后續(xù)株高基因的克隆以及功能驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，本研究利用BSR-seq技術(shù)與近等基因系相結(jié)合的方法進(jìn)行快速基因定位，為后續(xù)挖掘更多功能基因、推動(dòng)作物遺傳育種提供了參考方法。