劉建新，劉瑞瑞，賈海燕，卜 婷，李 娜

(甘肅省高校隴東生物資源保護與利用省級重點實驗室/隴東學院生命科學與技術學院,甘肅慶陽 745000)

土壤鹽堿化是制約農業(yè)生產和生態(tài)環(huán)境建設的全球性問題。據報道，全球鹽堿地面積大約 9.5×108hm2；中國西北、東北和濱海地區(qū)鹽堿地廣泛分布，總面積達3.6×107hm2，而且還呈逐年增加趨勢[1]。中國內陸鹽堿地鹽化和堿化多相伴發(fā)生，且成分復雜、程度各異，對農作物生長發(fā)育造成鹽堿混合脅迫[2]。土壤鹽化與堿化分別以鹽度和pH值升高為主要特征，但鹽堿混合脅迫并不是鹽脅迫(中性鹽脅迫)和堿脅迫(堿性鹽脅迫)的疊加，兩者間的協(xié)同效應對作物的傷害常遠大于單一鹽、堿脅迫[3]。關于作物鹽堿脅迫的研究目前多以單一鹽[4]或堿[5]脅迫為主，鹽堿混合脅迫研究相對少見。研究表明，鹽堿混合脅迫會降低土壤滲透勢，使作物離子失衡和生理代謝紊亂、生長受抑和產質量下降[2，6]。鹽堿混合脅迫也導致植物活性氧代謝失調[7]，降低線粒體功能[1]和葉綠體光能轉換效率，甚至引起植株死亡[6，8]。因此，探索增強植物耐受鹽堿脅迫的技術途徑，對合理有效利用鹽堿地資源，提高農作物產量和改善生態(tài)環(huán)境具有重要現實意義。

硫化氫(H2S)是繼NO和CO之后在植物體中發(fā)現的第3種氣體信號，它主要以L/D-半胱氨酸為底物通過L/D-半胱氨酸脫巰基酶催化產生[9]。目前，研究者多以NaHS作為外源H2S供體研究H2S對植物生長發(fā)育和生理代謝過程的調控，如用NaHS處理水蕹菜誘導了其內源H2S的產生，并由此改善植株能量狀況和增強抗氧化能力，從而延緩葉片的黃化和衰老[10]。H2S參與植物對各種逆境響應的調節(jié)，能夠提高植物對非生物脅迫的抗性，如提高植物抗旱性[11]、耐熱性[12]、抗冷性[13]和重金屬脅迫耐性[14]。H2S也可以增強植物的耐鹽性。朱會朋等[15]研究表明，H2S能促進NaCl脅迫下楊樹Na+外排和減弱K+外流；Deng等[16]指出，外源H2S主要通過降低Na+含量緩解NaCl脅迫對小麥幼苗的傷害；Chen等[17]證明，外源H2S通過NO介導的Na+/H+逆向轉運蛋白及H+-ATP酶基因表達影響Na+、K+穩(wěn)態(tài)，從而增強高鹽脅迫對大麥的傷害。H2S還可增強水稻[18]、玉米[19]和茶[20]對NaCl脅迫的抗性等。這些關于H2S調控植物耐鹽性的研究均以NaCl脅迫為條件，而有關鹽堿混合脅迫下植物對外源H2S的響應機制研究鮮見報道。裸燕麥(Avenanuda)是中國西部地區(qū)廣泛種植的一種禾本科燕麥屬雜糧作物，具有較強的耐鹽堿特性，被認為是改良鹽堿地的先鋒作物[2]。然而，鹽堿混合脅迫是裸燕麥生長發(fā)育和產質量提高的重要制約因素之一。本試驗以裸燕麥為材料，試圖通過盆栽沙培試驗，模擬裸燕麥種植區(qū)土壤鹽堿環(huán)境，研究噴施H2S供體NaHS對植株生長、葉片活性氧代謝和滲透物質積累的影響，揭示H2S調控植物抗鹽堿性的生理機制及探尋適宜的NaHS噴施濃度，以期為裸燕麥的抗鹽堿栽培提供理論依據和指導。

1 材料與方法

1.1 供試材料及培養(yǎng)

H2S供體硫氫化鈉(NaHS)和其他試劑均購自Sigma-Aldrich公司。模擬甘肅省中部裸燕麥種植區(qū)土壤鹽分組成，按摩爾比NaCl∶Na2SO4∶Na2CO3∶NaHCO3=12∶8∶1∶9配制50 mmol·L-1鹽堿混合溶液(濃度由預試驗確定)，鹽堿混合溶液配制參考文獻[21]的方法。

供試裸燕麥品種為定莜9號，種子購自甘肅省定西市農業(yè)科學研究院。挑選大小一致的健康裸燕麥種子，用1% NaClO消毒后在25 ℃催芽3 d，選發(fā)芽一致的萌發(fā)種子播種在塑料盆(口徑200 mm，高140 mm)的珍珠巖基質中，每盆播150粒左右，置于日光溫室常規(guī)培養(yǎng)，光強350～640 μmol·m-2·s-1，晝/夜溫度為(22±5)℃/(17±7)℃，相對濕度為(65±9)%。幼苗長至2葉期進行間苗，每盆選留一致壯苗約100株，3葉期時澆Hoagland營養(yǎng)液300 mL進行養(yǎng)分補充，2 d后按試驗設計進行處理。

1.2 試驗處理

試驗設7個處理：對照(CK)，根部澆蒸餾水+葉面噴蒸餾水；T0，根部澆50 mmol·L-1鹽堿混合溶液+葉面噴蒸餾水；T25，根部澆50 mmol·L-1鹽堿混合溶液+葉面噴25 μmol·L-1NaHS；T50，根部澆50 mmol·L-1鹽堿混合溶液+葉面噴50 μmol·L-1NaHS；T100，根部澆50 mmol·L-1鹽堿混合溶液+葉面噴100 μmol·L-1NaHS；T200，根部澆50 mmol·L-1鹽堿混合溶液+葉面噴200 μmol·L-1NaHS；T400，根部澆50 mmol·L-1鹽堿混合溶液+葉面噴400 μmol·L-1NaHS。

鹽堿混合溶液用Hoagland營養(yǎng)液配制。為避免鹽堿沖擊幼苗，按每天25 mmol·L-1遞增至50 mmol·L-1后記為處理開始。根部澆灌每2 d進行一次，每盆澆灌量300 mL；葉面噴施僅在根部澆灌鹽堿混合溶液達到50 mmol·L-1的第1天至第3天早晚各噴一次，以后不再噴施。噴施以葉片滴液為止，噴施量每盆15 mL左右，噴施液中添加0.01% Tween-80來降低表面張力。每4盆為1個重復，重復5次，隨機排列。處理 7 d后取幼苗功能葉用液氮速凍后-80 ℃保存，測定生理指標，處理14 d后分別測定幼苗根系和地上部生物量。

1.3 測定指標與方法

1.4 數據統(tǒng)計分析

采用Microsofte Excel 2007計算和整理數據，用SPSS 20.0軟件單因素方差分析(百分數數據進行反正弦平方根轉換)，用Duncan’s法差異顯著性檢驗(α=0.05)，結果用平均值±標準差表示。參考劉建新等[21]的方法計算生理指標的隸屬函數綜合評價值(D)，綜合評價H2S對鹽堿脅迫裸燕麥幼苗生理響應的調控作用。

2 結果與分析

2.1 外源H2S對鹽堿混合脅迫下裸燕麥幼苗葉片H2S含量和LCD活性的影響

與CK相比，鹽堿混合脅迫(T0)顯著提高了裸燕麥幼苗葉片內源H2S含量和LCD活性，增幅分別為18.9%和51.7%(圖1)。鹽堿混合脅迫下施用25～400 μmol·L-1NaHS處理(T25、T50、T100、T200、T400)均顯著提高了幼苗葉片內源H2S含量和LCD活性，且隨NaHS施用濃度升高，H2S含量和LCD活性呈不斷增加趨勢。

2.2 外源H2S對鹽堿混合脅迫下裸燕麥幼苗生長的影響

從表1可見，鹽堿混合脅迫(T0)下裸燕麥幼苗根、地上部鮮重和干重均顯著低于CK；鹽堿混合脅迫下，與T0處理相比，T25和T50處理可不同程度提高裸燕麥幼苗根、地上部鮮重和干重，其中T50處理的促進效果較好；其他噴施NaHS處理的根、地上部、全株的鮮重和干重與T0處理的差異不顯著或較之顯著下降。這說明噴施低濃度H2S可緩解鹽堿脅迫對裸燕麥幼苗生長的抑 制，高濃度H2S會加重鹽堿脅迫對生長的抑制 程度。

圖柱上不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖2～圖4同。

表1 外源H2S對鹽堿混合脅迫下裸燕麥幼苗生物量的影響Table 1 Effect of exogenous H2S on the biomass of naked oat seedlings under salt-alkaline mixed stress

2.3 外源H2S對鹽堿混合脅迫下裸燕麥幼苗葉片光合色素含量的影響

與CK相比，鹽堿混合脅迫(T0)顯著降低了裸燕麥幼苗葉片的葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜素含量(表2)。鹽堿混合脅迫下T25～T400處理的葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜素含量較T0處理分別提高6.3%～23.4%、 6.4%～19.3%、7.1%～21.4 %和 37.4%～ 118.7%，其中T100處理對總葉綠素含量影響最明顯，T50處理對類胡蘿卜素含量影響最大。

表2 外源H2S對鹽堿混合脅迫下裸燕麥幼苗光合色素含量的影響 Table 2 Effect of exogenous H2S on photosynthetic pigment contents of naked oat seedlings under salt-alkaline mixed stress mg·g-1

2.4 外源H2S對鹽堿混合脅迫下裸燕麥幼苗葉片含量和質膜相對透性的影響

表3 外源H2S對鹽堿混合脅迫下裸燕麥幼苗葉片 H2O2和MDA含量及質膜相對透性(RPPM)的影響Table 3 Effect of exogenous H2S on contents of and malondialdehyde(MDA) and relative permeability of plasma membrane(RPPM) in leaves of naked oat seedlings under salt-alkaline mixed stress

2.5 外源H2S對鹽堿混合脅迫下裸燕麥幼苗葉片抗氧化系統(tǒng)的影響

與CK相比，鹽堿混合脅迫(T0)顯著提高了裸燕麥幼苗葉片SOD、CAT和POD活性，降低了APX活性，對ASA和GSH含量無顯著影響(圖2)。鹽堿混合脅迫下，T25、T50、T100處理的SOD和CAT活性較T0處理均不同程度提高， T200處理的SOD和CAT活性與T0處理的差異不顯著，T400處理的SOD和CAT活性顯著低于T0處理；T25、T50、T100、T400處理的POD活性顯著低于T0處理，T200處理的POD活性與T0處理差異不顯著。T50、T100處理顯著提高了APX活性，而T25和T200處理的APX活性與T0處理差異不顯著，T400處理的APX活性顯著下降； T25～T400處理對裸燕麥葉片ASA含量無顯著影響，但均不同程度提高GSH含量，其中T50、T100、T200和T400處理的GSH含量增加20.6%、 33.0%、29.0%和35.7%，與T0處理差異均 顯著。

2.6 外源H2S對鹽堿混合脅迫下裸燕麥幼苗葉片滲透調節(jié)物質含量的影響

由圖3可知，與CK相比，鹽堿混合脅迫(T0)顯著提高了裸燕麥葉片游離氨基酸、脯氨酸和可溶性蛋白質含量，降低了可溶性糖含量。鹽堿混合脅迫下，與T0處理相比，T25處理對游離氨基酸含量無顯著影響，但顯著提高脯氨酸含量；T50、T100、T200、T400處理的游離氨基酸含量顯著降低；T25處理的可溶性糖含量顯著降低， T50處理顯著升高， T100、T200和T400處理變化不大；T25～T400處理對可溶性蛋白質含量均無顯著影響。

圖2 外源H2S對鹽堿混合脅迫下裸燕麥葉片SOD、CAT、POD和APX活性及ASA、GSH含量的影響Fig.2 Effects of exogenous H2S on SOD,CAT,POD and APX activities and ASA and GSH contents in leaves of naked oat seedlings under salt-alkaline mixed stress

圖3 外源H2S對鹽堿混合脅迫下裸燕麥葉片游離氨基酸、脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白質含量的影響Fig.3 Effects of exogenous H2S on the contents of free amino acid,proline,soluble sugar and soluble protein in leaves of naked oat seedlings under salt-alkaline mixed stress

2.7 外源H2S對鹽堿混合脅迫下裸燕麥幼苗生理效應的隸屬函數綜合評價

由圖4可見，鹽堿混合脅迫(T0)的綜合評價值(D) 略高于CK，但差異不顯著；鹽堿混合脅迫下T25、T50和T100處理之間D值差異不顯著，但顯著高于其他處理，說明噴施一定濃度的H2S對裸燕麥幼苗生理有明顯的綜合改善效應。

圖4 隸屬函數綜合評價外源H2S對 裸燕麥幼苗耐鹽堿性的影響Fig.4 Effects of exogenous H2S on the tolerance of naked oat seedlings to salt-alkaline were evaluated by membership function

3 討 論

植物體內H2S可通過LCD催化半胱氨酸分解成丙酮酸和氨時產生[9]。本試驗結果表明，鹽堿混合脅迫下裸燕麥幼苗葉片LCD活性和H2S含量顯著升高(圖1)，說明LCD催化產生的H2S可能參與裸燕麥對鹽堿脅迫的響應。Riemenschneider等[27]發(fā)現，外源H2S可誘導擬南芥內源H2S含量和LCD活性提高。本試驗中，噴施25～400 μmol·L-1NaHS提高了鹽堿混合脅迫下裸燕麥葉片H2S含量和LCD活性，且H2S含量和LCD活性隨NaHS濃度增大而提高(圖1)。這與前人在單一鹽脅迫下其他植物上的研究結果一致[28]，說明外施H2S供體能夠通過激活LCD活性提高鹽堿脅迫下植物內源H2S的含量。