高 煜，程 斌，丁延慶，曹 寧 ，高 旭，張立異,

(1.貴州大學農(nóng)學院，貴州貴陽 550025； 2.貴州省農(nóng)業(yè)科學院旱糧研究所，貴州貴陽 550006)

小麥(TriticumaestivumL.)是世界上最重要的農(nóng)作物之一，全球近35%的人口以小麥為主食[1]。小麥白粉病是由白粉菌(Blumeriagraminisf. sp.Tritici)引起的危害小麥植株地上部分的真菌病害，在世界各麥區(qū)都有發(fā)生[2-4]。西南地區(qū)獨特的氣候條件，使其成為我國白粉病發(fā)生普遍且危害較為嚴重的地區(qū)。農(nóng)藥是減輕白粉病發(fā)生的一項措施，但過度使用會造成環(huán)境污染，影響小麥的品質(zhì)，所以培育抗病品種是防治白粉病最為經(jīng)濟有效且環(huán)境友好的措施[5]。

發(fā)掘新的抗病基因是防治白粉病的常用育種策略。1930年，澳大利亞學者Waterhouse首次發(fā)現(xiàn)并報道了第一個抗白粉病基因[6]。此后，Sears等[7]在加拿大小麥品種Axminster的7AL染色體上也定位一個抗白粉病基因Pm1a。迄今為止，在小麥及其近緣種屬中已有90多個抗白粉病基因(Pm1～Pm65)被正式命名[8-10]。但是白粉病菌的快速變異，導致大部分抗病基因喪失抗性[11]。目前，抗白粉病基因Pm21在我國廣泛使用，它來源于簇毛麥6VS染色體上，具有很好的廣譜抗性和持久性[12]。但是單一抗病基因的過度利用，也會對小麥生產(chǎn)造成威脅。因此，不斷挖掘新的抗病基因?qū)Ψ乐伟追鄄【哂兄匾饬x。

全基因組關聯(lián)分析(genome-wide association study, GWAS)技術可以直接鑒定出與表型變異顯著關聯(lián)的SNP或者基因位點，目前已經(jīng)大量應用于小麥重要性狀的功能性等位變異檢測及基因研究中[13]。隨著基因芯片和測序技術的快速發(fā)展，基于SNP標記的GWAS在抗病基因定位中得到廣泛應用[14-15]。通過GWAS分析，Li等[16]成功定位了位于2B染色體上的三個白粉病抗性位點，并進行了驗證；Liu等[17]用185個美國冬小麥品種確定了9個與白粉病抗性顯著相關的SNP標記。

本研究以主要來源于我國西南地區(qū)的120個小麥品種(系)為材料，利用小麥90K SNP芯片對白粉病抗性進行GWAS分析，確定抗白粉病基因或QTL，并發(fā)掘與已知白粉病基因緊密連鎖的分子標記，以期為小麥白粉病的遺傳改良和種質(zhì)資源的有效利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及白粉病抗性鑒定

120個普通小麥品種(系)分別來源于貴州(62個)、四川(36個)和國內(nèi)其他地區(qū)(河南、湖北、甘肅、江蘇等，共22個)(表1)。于2012―2013年度分別種植于貴州省貴陽市、貴州省赫章縣和四川省綿陽市，于2013―2014種植于貴州省貴陽市，形成四個不同環(huán)境條件。試驗采用隨機區(qū)組設計，3次重復，行長1 m，行距30 cm。以高感白粉病的銘賢169為誘發(fā)材料，每隔五行種植一行，確保發(fā)病充分。常規(guī)大田管理，以環(huán)境中白粉病菌混合生理小種誘發(fā)材料自然發(fā)病。待銘賢169充分發(fā)病時調(diào)查記錄白粉病反應型，采用0～4級分級標準，其中0表示免疫，0；表示近免疫，1表示高抗，2表示中抗，3表示中感，4表示高感[18]。

1.2 DNA提取、90K SNP芯片分型和標記掃描

采用改良的CTAB法[19]提取供試材料單株幼嫩葉片DNA。利用小麥90K iSelect SNP芯片(包括81 587個SNP標記)對120個小麥品種(系)進行SNP分型。芯片檢測在中玉金標記公司完成。利用與抗白粉病基因Pm21緊密連鎖的分子標記SCAR1265(R: 5′-CACTCTCCTCAAACCTTGCAAG-3′；L:5′-CACTCTCCTCCACTAACAGAGG-3′)對這120份小麥材料進行PCR擴增，并用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，統(tǒng)計在1 265 bp處的擴增片段，有DNA條帶的記為1，無帶記為0。

1.3 數(shù)據(jù)分析

群體結構分析：使用Genome Studio軟件進行SNP分型，剔除數(shù)據(jù)缺失頻率>20%、最小等位基因頻率<5%的SNP標記，保留高質(zhì)量的SNP標記進行數(shù)據(jù)分析。利用Structure 2.3.4 軟件對該群體進行群體結構分析[20]，設置亞群數(shù)目K為1～12，5次模擬運算，模擬參數(shù)迭代(length of bum-in period)和蒙特卡羅迭代(markov chain monte carlo,MCMC)設置為 10 000次循環(huán)，在混合模型和頻率相關模型下運算。輸出后驗概率值的結果輸入Structure Harvester(http://taylor0.biology.ucla.edu/struct-ure Harvester/)，計算2個連續(xù)的后驗概率值的變化速率(ΔK)和每個材料在1～12亞群的Q值，以Q=0.5為分界線，最終確定群體的數(shù)目和結構。

主成分分析(principal component analysis，PCA)：運用R語言包GAPIT對自然群體進行PCA群體結構分析和親緣關系評估，計算親緣關系K矩陣。親緣關系代表兩個特定材料之間的遺傳相似度與任意材料之間遺傳相似度的相對值，當供試材料之間的親緣關系值為負值時，將其定義為0[21]。

表1 120個小麥品種(系)的名稱、來源及其在主成分分析(PCA)中的類群Table 1 Names, origins and PCA(principal component analysis) groups of 120 wheat varieties(lines)

全基因組關聯(lián)分析(GWAS)：利用質(zhì)控后得到的37 790個高質(zhì)量的SNP標記，運用R語言包GAPIT中的FarmCPU模型(http://zzlab.net/FarmCPU/index.html)[22]對4個環(huán)境下小麥品種的抗白粉病表型分別進行GWAS，閾值為 -log10(2.6×10-7)(以顯著性水平為0.01，質(zhì)控后得到的37 790個高質(zhì)量SNP標記來計算閾值)，判定SNP標記與目標性狀關聯(lián)的顯著性。

相關性分析：利用SPSS v20軟件，計算Pm21連鎖標記SCAR1265與6A染色體上顯著關聯(lián)SNP標記的Pearson相關系數(shù)。

表2 4個環(huán)境下120個小麥品種(系)中抗病 和感病品種(系)的比例Table 2 Ratio of resistant and susceptible varieties(lines) to 120 wheat varieties(lines) in four environments %

2 結果與分析

2.1 小麥品種(系)成株期抗白粉病鑒定結果

從表2可以看出，不同環(huán)境下抗病材料所占比例不同，其中，2014年貴陽環(huán)境條件下，白粉病表現(xiàn)抗性的品種(系)占比最高(70.8%)，2013年綿陽環(huán)境條件下占比最低(36.7%)。36個品種(系)(30%)在四種環(huán)境下均表現(xiàn)為抗病，其中，貴州省品種(系)30個，四川省品種(系)4個，其他地區(qū)品種(系)2個(表3)。另外有18個品種(系)在四個環(huán)境下都表現(xiàn)為感病，包括貴州省品種(系)4個，四川省品種(系)9個，其他地區(qū)品種(系)5個。在不同環(huán)境下，抗病品種(系)中來自貴州省的都最多，占比均超過50%，其次是四川省，其他地區(qū)抗病品種(系)比例較低(表4)。由此可見，本試驗中貴州省小麥品種(系)的抗病性表現(xiàn)較好。

2.2 群體結構分析

從圖1可以看出，當K=6時，ΔK取得最大值，因此，試驗群體可分為6個類群。其中，第一類群[20個品種(系)]、第二類群[27個品種(系)]和第四類群[20個品種(系)]的小麥材料主要來自貴州省和四川省，第三類群[13個品種(系)]和第五類群[20個品種(系)]的小麥材料主要來自貴州省，第六類群[20個品種(系)]的小麥材料來自其他地區(qū)。

為了進一步了解這些小麥材料的親緣關系，對供試材料進行主成分分析。結果(圖2)表明，120個小麥品種(系)按地理來源聚集形成兩個類群。PC1解釋了全部遺傳變異的12.8%，PC2解釋了全部遺傳變異的8.4%。位于圖2左上側的類群主要由來自四川省和其他地區(qū)的小麥品種(系)組成，在PC2水平上分布較為集中。來源于貴州省的小麥品種(系)以及銘賢169聚集在右下側，在PC1水平上分布較分散，其中由貴州大學選育的小麥品種(系)(包括貴農(nóng)系列、TP2、硬葡1等)分布更分散。

2.3 全基因組關聯(lián)分析(GWAS)

利用37 790個SNP標記對120個小麥品種(系)在四個環(huán)境中的白粉病抗性分別進行GWAS，共檢測到16個與白粉病抗性顯著關聯(lián)的SNP標記(圖3、表5)，分布于1A(2)、1D(2)、2A(2)、3A(2)、4B(1)、5B(1)、6A(3)、6D(2)和7B(1)染色體上。

在2013年貴陽環(huán)境條件下，檢測到6個與白粉病抗性顯著關聯(lián)的SNP標記，分別位于1A、1D、3A、4B、5B和6A染色體上。在2013年赫章環(huán)境條件下，只檢測到1個與白粉病抗性顯著關聯(lián)的SNP，位于6A染色體上。在2013年貴陽環(huán)境條件下，檢測到6個與白粉病抗性顯著關聯(lián)的SNP標記，分別位于1D、3A、4B、6A和6D染色體上。在2014年貴陽環(huán)境條件下，共檢測到6個與白粉病抗性顯著關聯(lián)的SNP標記，分別位于1A、2A、6A、6D和7B染色體上。

有多個染色體區(qū)段在2～4個環(huán)境中均被檢測到。其中，位于6AS染色體大約44 cM處的區(qū)段，在4個環(huán)境中均被檢測出與白粉病抗性顯著關聯(lián)，包含3個SNP位點，其中，Jagger_c4823_169在2013年貴陽和2013年綿陽兩個環(huán)境中均被檢測到，位于6A染色體43.85 cM處，P值分別為 7.24E-53和5.76E-27；Tdurum_contig55201_928在2013年赫章環(huán)境中被檢測到，位于6A染色體44.06 cM處，P值為2.39E-08；Tdurum_contig12215_89在2014年貴陽環(huán)境中被檢測到，位于6A染色體44.11 cM處，P值為4.17E-30，這3個SNP標記均顯示與白粉病抗性顯著關聯(lián)。位于3A染色體43.44 cM處的SNP(Excalibur_c3510_1888)和位于4B染色體49.44 cM處的SNP(BS00011148_51)在2013年貴陽和2013年綿陽兩個環(huán)境中均被檢測到，且與白粉病抗性顯著 關聯(lián)。

表3 四種環(huán)境下均表現(xiàn)抗病的品種(系)Table 3 Resistant varieties(lines) in four environments

表4 4種環(huán)境中不同地區(qū)抗病品種(系)的頻率Table 4 Percentage of resistant varieties(lines) from different regions in four environments %

A：△K折線圖；B：群體結構分析。

圖2 120個小麥品種(系)的主成分分析Fig.2 Principal component analysis of 120 wheat varieties(lines)

2.4 相關性分析

為了進一步驗證6A染色體上的重要位點與抗白粉病基因Pm21的關系，利用與Pm21緊密連鎖的分子標記SCAR1265對這120個小麥品種(系)小麥材料進行掃描，部分小麥品種的PCR擴增結果如圖4所示。分型結果顯示，這3個SNP標記(Jagger_c4823_169，Tdurum_contig55201_928，Tdurum_contig12215_89)與SCAR1265的Pearson相關系數(shù)R值分別為0.85、0.77和0.87(P<0.01)，說明這3個SNP標記與Pm21分子標記位點緊密連鎖。

3 討 論

3.1 西南地區(qū)小麥白粉病抗性

小麥白粉病常發(fā)生在潮濕的地區(qū)，而西南地區(qū)因其特有的氣候地理特征，使得白粉病菌能夠安全越夏，并加快生理小種的變異，這是西南地區(qū)小麥白粉病及其他病害高發(fā)的重要原因。

本研究抗性鑒定結果顯示，2014年貴陽環(huán)境條件下抗白粉病的小麥品種(系)占比最高，原因可能是由于當年氣候較為干燥，導致白粉病發(fā)病不充分。在120個小麥品種(系)中，有36個在四個環(huán)境下都表現(xiàn)為抗病，其中，來自貴州省的小麥品種(系)中抗病品種比例最高，原因可能是貴州麥區(qū)白粉病菌的毒力強，而在植物-病菌協(xié)同進化過程中，育種家通過人工選擇，使該地區(qū)小麥品種具有較好的抗病性[23]。這對貴州地區(qū)小麥抗白粉病品種抗性基因資源的利用和推廣有重要的 意義。

綠色線為SNP顯著性的閾值,等于-log10(2.6×10-7)。

3.2 西南地區(qū)小麥白粉病的全基因組關聯(lián)分析(GWAS)

本研究全基因組關聯(lián)分析結果顯示，16個SNP標記與白粉病抗性顯著關聯(lián)，分布在1A、1D、2A、3A、4B、5B、6A、6D和7B染色體上，其中，3A、4B和6A染色體上分別有1個重要的染色體區(qū)段在2或4個環(huán)境中均能被檢測到。

本研究在2013年貴陽和2013年綿陽兩個環(huán)境條件下，分別在3A(約43.44 cM)和4B(約 49.44 cM)染色體的兩個區(qū)段檢測到與白粉病抗性顯著關聯(lián)的SNP位點。目前，3A染色體上已鑒定出的抗白粉病基因為Pm44，而4B染色體上暫無報道[24-25]。Lillemo等[26]利用Saar和Avocet構建的113個重組自交系群體，在3AS和4BL染色體上分別檢測到一個抗白粉病QTL，均與本研究檢測到的位點不同。Keller等[27]利用Forno和Oberkulmer構建的226個重組自交系，分別在3A(40～62 cM)和4B(84～88 cM)染色體上檢測到一個抗白粉病QTL，推測本研究在3A染色體上檢測到的位點位置與前人研究結果相似，而在4B染色體上檢測到的位點位置不同。Liang等[28]利用Fukuho-komugi和Oligoculm構建的107個DH群體，在4BL(41.38～44.59 cM)染色體上檢測到一個抗白粉病QTL，推測與本研究在4B染色體上的SNP位點位置相似。本研究供試小麥品種(系)中能夠同時檢測到這兩個位點的品種(系)有硬葡1、硬葡2和一粒葡8-1等材料，均來自貴州省。目前，這些材料對小麥白粉病仍然表現(xiàn)出較好的抗病性，在育種中具有一定的利用價值。

本研究在四個環(huán)境條件下，在6AS染色體43.85～44.11 cM區(qū)段檢測到3個與白粉病抗性顯著相關的SNP標記，分別為Jagger_c4823_169、Tdurum_contig55201_928和Tdurum_contig12215_89。6AS染色體上已鑒定出的抗白粉病基因為Pm21，與Pm21緊密連鎖的分子標記為SCAR1265[29]。本研究檢測到的3個SNP標記也與Pm21緊密連鎖。在120個小麥品種(系)中，能夠同時檢測到這4個SNP標記的有33個，其中來自貴州省的有26個，包括安麥7號、308、黔麥12、黔麥18、黔麥19、夏繁28、黔9939-5、貴農(nóng)18、貴農(nóng)22、貴農(nóng)25、貴農(nóng)26、貴農(nóng)28、貴農(nóng)775、節(jié)燕普3號、TG、TP2、TP3、P5-1、以光-3、以特選1、以特選2、固優(yōu)1、貴協(xié)4、P13-1、P13-3和P13-5；來自四川省的有5個，包括綿麥185、綿麥228、綿麥367、綿麥37和綿麥39；來自其他地區(qū)的有2個，包括92R137和南農(nóng)24。Jagger_c4823_169、Tdurum_contig55201_928、Tdurum_contig12215_89這3個SNP位點和分子標記SCAR1265在西南地區(qū)小麥品種(系)中出現(xiàn)的頻率較高，分別為37.8%、34.7%、35.7%和 41.8%，說明西南地區(qū)小麥品種(系)中含有Pm21基因的品種(系)較多。江 崢等[30]利用開發(fā)的Pm21特異性標記對662個小麥品種(系)進行檢測，發(fā)現(xiàn)西南地區(qū)小麥材料中Pm21的使用頻率最高 (34.4%)；鄒景偉[31]利用Pm21的連鎖標記對參試品種進行檢測，發(fā)現(xiàn)有15個品種可能含有Pm21基因，其中，有11個來自西南冬麥區(qū)，與本研究結果一致。說明Pm21基因在西南地區(qū)小麥品種(系)中分布頻率較高，有加大病原菌定向選擇壓力的風險，對西南地區(qū)小麥生產(chǎn)造成威脅。因此，在今后的小麥抗病育種工作中，要加強白粉病新抗源的發(fā)掘，同時通過多個抗病基因的聚合，選育抗病性更為持久的小麥品種。

表5 小麥白粉病抗性顯著相關的SNP標記Table 5 Significant SNP markers associated with wheat powdery mildew resistance

M: DL2000；1：黔麥17；2：黔麥18；3：黔麥19；4：夏繁28；5：黔9939-5；6：豐優(yōu)1號；7：豐優(yōu)2號；8：豐優(yōu)3號；9：豐優(yōu)6號；10：豐優(yōu)7號；11：豐優(yōu)8號；12：豐優(yōu)9號；13：豐優(yōu)10號；14：豐優(yōu)92212；15：興育7號；16：興育823；17：CN04-1；18：淮麥18；19：92R137；20：南農(nóng)04y10；21：南農(nóng)24；22：南農(nóng)06y603；23：小偃54；24：綿麥1403；25：綿麥185；26：綿麥228；27：綿麥367；28：綿麥37；29：綿麥39。

4 結 論

本試驗對主要來源于西南地區(qū)的120個小麥品種(系)的白粉病抗性進行GWAS，獲得16個與白粉病抗性顯著相關的SNP位點。在6A染色體上有3個SNP標記，遺傳距離小于1 cM，與Pm21基因緊密連鎖。本研究結果說明，Pm21在西南地區(qū)小麥白粉病抗性育種中發(fā)揮了巨大作用。但在今后的小麥抗病育種中應該使用更多不同的抗病基因，以降低Pm21過度使用給西南地區(qū)的小麥生產(chǎn)帶來風險。