孫長河，楊國旺

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，北京 100029； 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，北京 100010)

肺癌是目前我國及全世界范圍內(nèi)發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤[1]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者約占所有原發(fā)性肺癌患者的80%～85%，吸煙與被動吸煙、室內(nèi)污染、室內(nèi)氡暴露、室外空氣污染、職業(yè)因素、肺癌家族史和遺傳易感性等均為其危險因素[2]。

NSCLC屬中醫(yī)學(xué)“肺積”“肺萎”及“息賁”等范疇，相關(guān)學(xué)術(shù)理論較多，《黃帝內(nèi)經(jīng)》中“正氣存內(nèi)，邪不可干”指出肺癌發(fā)病正虛為本，“溫氣不行，凝血蘊里而不散，津液澀滲，著而不去，而積皆成矣”指出瘀血為其病因；朱丹溪在《丹溪心法》中提出“凡人身上、中、下有塊者，多是痰”；尤在涇在《金匱要略心典》中提出“痞堅之處，必有伏陽”，張澤生、周仲英等醫(yī)家提倡癌毒學(xué)說，亦有醫(yī)家提出“陰陽氣不相順接”是腫瘤的病機基礎(chǔ)。中藥治療多以扶正、理氣、化痰、活血、解毒和清熱散節(jié)等治法組合應(yīng)用[3-4]。

北豆根(Menispermi Rhizoma)為防己科植物蝙蝠葛的干燥根莖，味苦，性寒，有小毒，歸肺、胃、大腸經(jīng)，具有清熱解毒、祛風止痛的功能，用于咽喉腫痛、熱毒瀉痢及風濕痹痛的治療[5]。文獻報道，北豆根的成分存在抗腫瘤作用[6-7]。白附子(Typhonii Rhizoma)為天南星科植物獨角蓮的干燥塊莖，味辛，性溫，有毒，歸胃、肝經(jīng)，具有祛風痰、定驚搐、解毒散結(jié)、止痛的功能，用于中風痰壅、口眼斜、語言謇澀、驚風癲癇、破傷風、痰厥頭痛、偏正頭痛、瘰疬痰核及毒蛇咬傷[5]。文獻報道，白附子的提取物存在抗腫瘤活性[8]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究是基于大數(shù)據(jù)技術(shù)，以多成分、多靶標、多通路的研究方式，與中藥及中藥處方中配伍所達到的系統(tǒng)的整體觀、辨證論治特點相匹配，是研究中藥復(fù)方化學(xué)成分的相互作用機制的適宜方法[9-11]。本研究在分析楊國旺教授治療的肺癌病例時發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用北豆根-白附子配伍的患者的生存期較長。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的方式，探討北豆根-白附子配伍抗NSCLC的潛在作用機制。

1 資料與方法

1.1 活性成分篩選

藥物化學(xué)成分篩選：利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)搜索“北豆根”“白附子”，得到其所有成分化合物，按口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18篩選，記錄篩選后的潛在有效化合物的Pubchem CID或SID及結(jié)構(gòu)(structure)。

1.2 化合物靶點預(yù)測

記錄“1.1”項中獲取有Pubchem CID/SID的化合物，導(dǎo)入Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取其結(jié)構(gòu)簡式，將其導(dǎo)入和Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)進行靶點預(yù)測。同時，記錄“1.1”項中無Pubchem CID/SID及Swiss Target Prediction無法預(yù)測靶點的化合物的結(jié)構(gòu)，基于ChEMBL數(shù)據(jù)庫(https://www.ebi.ac.uk/chembl/)獲取化合物的結(jié)構(gòu)式，導(dǎo)入PharmMapper平臺(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)預(yù)測靶點信息。為全面分析預(yù)測北豆根-白附子的化合物，在2種方式預(yù)測的靶點中各取可能性居前50位的靶點合并。

1.3 疾病靶點預(yù)測

利用人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man，OMIM)(https://omim.org/)數(shù)據(jù)庫檢索“NSCLC”，獲取NSCLC相關(guān)的前50位基因，作為疾病相關(guān)的核心基因。運用Cytoscape 3.6.1軟件。導(dǎo)入HYRD數(shù)據(jù)庫(http://www.hprd.org/)人類蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein Interaction，PPI)數(shù)據(jù)作為背景網(wǎng)絡(luò)，篩選與NSCLC直接相關(guān)的基因蛋白，并取其直接相關(guān)的蛋白，作為疾病的相關(guān)靶點。

1.4 網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建與分析

根據(jù)預(yù)測的北豆根-白附子潛在有效化合物、相應(yīng)的靶點基因，使用Cytoscape 3.6.1軟件建立“藥物-成分化合物-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)，以藥物、成分化合物、靶點及疾病為節(jié)點，節(jié)點之間連線表示兩個節(jié)點相互存在聯(lián)系。

1.5 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)

將北豆根、白附子成分化合物的靶蛋白與疾病相關(guān)靶點匹配，獲得藥物成分化合物在疾病相關(guān)蛋白上的靶點，導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，設(shè)置置信度為0.9，隱藏獨立的點，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.6 化合物在人類靶點的功能和通路富集分析

由于NSCLC是一種全身性的綜合性的疾病，NSCLC病因與影響因素復(fù)雜，使得中藥復(fù)方在抗腫瘤的機制方面必然不是單一路徑。為全面分析北豆根-白附子配伍在防治NSCLC方面的作用，使用R 4.0.2軟件，運行“clusterProfiler”包，取P<0.05，將各成分化合物前50位靶點進行基因本體(gene ontology, GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 北豆根、白附子有效成分篩選結(jié)果

按照“1.1”對北豆根基白附子的潛在有效成分篩選，表1顯示，北豆根通過篩選獲得10種潛在有效成分，分別為左旋千金藤啶堿(l-SPD)、苦參堿(matrine)、dauricumine、碎葉紫堇堿(cheilanthifoline)、去羥尖防已堿(acutuminine)、蝙蝠葛辛堿(bianfugecine)、山豆根波芬諾靈堿(dauriporphinoline)、千金藤林堿(stepharine)、青藤堿(sinomenine)及dauricline；白附子通過篩選獲得3種潛在有效成分，分別為亞油酸乙酯(mandenol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)及谷甾醇(sitosterol)。

表1 北豆根、白附子中篩選的潛在有效成分及其PubChem主要信息Tab 1 Potential active components and its PubChem information in menispermi rhizoma and typhonii rhizoma

2.2 化合物靶點預(yù)測結(jié)果

按“1.2”項下方法進行檢索，共11種化合物獲得了相應(yīng)的結(jié)構(gòu)簡式，導(dǎo)入Swiss Target Prediction平臺，獲得預(yù)測靶點；其余2種化合物于ChEMBL數(shù)據(jù)庫檢索獲取相應(yīng)的結(jié)構(gòu)式，導(dǎo)入PharmMapper平臺預(yù)測靶點信息。對于兩處獲得的靶點，每種化合物取可能性最高的前50個蛋白靶點合并，共獲得668個靶點。

2.3 疾病靶點預(yù)測結(jié)果

通過OMIM數(shù)據(jù)庫檢索NSCLC詞條，將獲取的前50個基因納入HYRD數(shù)據(jù)庫的PPI網(wǎng)絡(luò)，共獲取了1 167個相關(guān)蛋白靶點。表明NSCLC相關(guān)病因及影響因素眾多，相關(guān)機制復(fù)雜。

2.4 網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建與分析結(jié)果

使用Cytoscape 3.6.1軟件，將“2.3”項中PPI網(wǎng)絡(luò)作為背景網(wǎng)絡(luò)，篩選其中與藥物化合物的共同靶點，共獲得101個共同靶點，構(gòu)建“藥物-成分化合物-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)，見圖1。可見，共有12個化合物存在疾病相關(guān)基因的靶點，其中dauriporphinoline的靶點數(shù)最多，為18個。

圖1 藥物-成分化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)Fig 1 Drug-component-target-disease network

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

將藥物與疾病共同靶點導(dǎo)入STRING平臺(11.0 Version)(confidence取0.9，隱藏獨立的節(jié)點)，共獲得92個節(jié)點，獲得所示PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖2。

圖2 “藥物-疾病靶點”的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig 2 PPI network of “drug-disease target”

2.6 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析

2.6.1 GO功能富集分析：使用R 4.0.2軟件，將數(shù)據(jù)提交至Bioconductor數(shù)據(jù)庫，取P<0.05，對預(yù)測獲得的所有藥物靶基因進行GO分析，并按照參與該功能基因的數(shù)量和顯著性(P值)進行排序，共查詢到276條目，GO活性前30條結(jié)果見圖3，GO數(shù)目前30條結(jié)果見圖4。其中，富集到活性最高的是蛋白酪氨酸激酶活性(protein tyrosine kinase activity)，主要涉及ALK、ERBB2及EGFR等54個基因；富集到基因數(shù)量最多的是絲氨酸/蘇氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)，主要涉及GSK3B、EGFR及SYK等89個基因。以上2種GO均與細胞生長、增殖和分化相關(guān)。

圖3 北豆根-白附子預(yù)測靶點GO功能富集分析活性Fig 3 GO function analysis of prediction target of menispermi rhizoma and typhonii rhizoma

圖4 北豆根-白附子預(yù)測靶點GO功能富集數(shù)目Fig 4 Number of GO function analysis of prediction target of menispermi rhizoma and typhonii rhizoma

2.6.2 KEGG通路富集分析：使用R 4.0.2軟件，將數(shù)據(jù)提交至Bioconductor數(shù)據(jù)庫進行KEGG通路富集分析，并按照參與該功能基因的數(shù)量和顯著性(P值)進行排序，結(jié)果見圖5。其中NSCLC關(guān)鍵通路有26個基因參與，分別是STAT3、ALK、JAK3、PRKCA、BRAF、AKT1、MAPK1、MAP2K1、PIK3CA、ERBB2、EGFR、BAD、MET、PIK3CD、CDK4、TP53、PIK3CB、PIK3R1、RAF1、RXRA、PDPK1、MAPK3、PRKCG、PRKCB、RARB及RXRG。靶點基因在該通路上的覆蓋情況見圖6。其中，P53、RXR受體以及PI3K的可能性最高，P53基因的表達激活P53信號通路癌細胞凋亡；RAR、RXR受體參與了包括細胞生長、分化、代謝和胚胎發(fā)育等許多重要生理過程的調(diào)節(jié)，在NSCLC細胞中表達失調(diào)[12]；RAF靶點通過MAPK信號通路調(diào)控細胞增殖；PI3K通過磷酸化PIP2產(chǎn)生PIP3激活A(yù)kt，PI3-Akt信號通路調(diào)控細胞凋亡[13-14]。

圖5 北豆根-白附子預(yù)測靶點KEGG通路富集分析Fig 5 KEGG pathway analysis of prediction target of menispermi rhizoma and typhonii rhizoma

圖6 NSCLC通路圖及北豆根-白附子靶基因Fig 6 NSCLC pathway map and target gene of menispermi rhizoma-typhonii rhizoma

除目標NSCLC通路外，亦觀察到北豆根-白附子參與多條關(guān)鍵通路與NSCLC相關(guān)，如細胞凋亡(Apoptosis)、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、ErbB信號通路(ErbB signaling pathway)、血管內(nèi)皮生長因子信號通路(VEGF signaling pathway)、PD-L1在腫瘤中的表達與PD-1檢查點通路(PD-L1 expression and PD-1 checkpoint pathway in cancer)、癌癥中的蛋白多糖(Proteoglycans in cancer)以及癌癥的中心碳代謝(Central carbon metabolism in cancer)等。

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步探討了北豆根-白附子配伍治療NSCLC的分子機制。NSCLC的發(fā)生發(fā)展是復(fù)雜的過程，涉及多系統(tǒng)、多種基因及蛋白機制的病理改變。北豆根-白附子配伍在治療NSCLC的機制方面表現(xiàn)為多種成分-多通路-多靶點的特點，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方式研究預(yù)測的13種化合物，通過單獨或共同靶點作用于人體，其中12種化合物作用于NSCLC相關(guān)靶點。既往研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苦參堿可上調(diào)肺癌A549細胞中自噬的特異性標志物LC3-Ⅱ蛋白表達水平，誘導(dǎo)A549細胞自噬[15-16]。青藤堿可抑制肺癌 HCC827、H460和H1975細胞增殖，同時可觀察到增殖標志物磷酸化組蛋白H3 S10(p-H3 Ser10)表達的下調(diào)[17]；并可通過抑制miR-21的表達從而上調(diào)TIMP-1、TIMP-2和反轉(zhuǎn)錄富含半胱氨酸蛋白(RECK)的表達，并下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和基質(zhì)金屬蛋白酶胞外誘導(dǎo)劑(EMMPRIN/CD147)表達，從而逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，最終抑制肺癌A549和H1299細胞侵襲和遷移[18]。青藤堿誘導(dǎo)凋亡的通路可能存在于PI3K/Akt、ERK通路之外[19]。β-谷甾醇在體外以劑量依賴的方式抑制肺癌A549、NCI-H460細胞生長，可將A549細胞周期阻滯于G2/M期，并誘發(fā)細胞凋亡[20]。

雖然已有北豆根-白附子配伍所含部分化合物的抗NSCLC機制研究，但仍有較多化合物的機制不甚明確，故本研究利用GO功能分析和KEGG富集分析探討可能存在的抗腫瘤蛋白功能靶點及作用機制。在KEGG富集分析中，富集到多條腫瘤相關(guān)的通路，顯示北豆根-白附子配伍的廣譜抗腫瘤的特性，提示其可能在表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑耐藥、血管生成、免疫逃逸、細胞凋亡和調(diào)節(jié)腫瘤碳代謝等方面發(fā)揮抗NSCLC的作用。也為北豆根-白附子配伍相關(guān)化合物抗腫瘤作用的進一步研究打下基礎(chǔ)。

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步預(yù)測了北豆根-白附子配伍治療NSCLC潛在有效成分的作用機制，可為相應(yīng)研究提供理論指導(dǎo)。但由于藥效成分多種多樣，在早期化合物篩選過程中可能遺漏潛在的有效成分；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過分子結(jié)構(gòu)功能的預(yù)測，初步篩選可能存在的效應(yīng)通路，但仍存在預(yù)測的不確定性，化合物數(shù)據(jù)庫尚待完善，尚具有新化合物、新靶點和新通路發(fā)現(xiàn)的可能。中藥成分復(fù)雜而多樣，相關(guān)研究開展難度大，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合已有資料進行分析研究，不失為探索中藥復(fù)雜成分組合藥理的有效方法。