丁志剛

(首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院麻醉科，北京 100038)

膀胱癌是泌尿外科常見的惡性腫瘤之一。經(jīng)尿道切除和膀胱內(nèi)化療聯(lián)合治療是非肌肉浸潤性膀胱癌的重要治療策略，但大多數(shù)患者仍會復發(fā)，最終約20%的復發(fā)腫瘤侵襲局部肌肉或轉(zhuǎn)移[1]。膀胱癌的難治性與其浸潤特性有關(guān)?；仡櫺匝芯拷Y(jié)果顯示，局部麻醉在預防腫瘤轉(zhuǎn)移和復發(fā)中發(fā)揮了重要作用[2]。利多卡因是臨床常用的麻醉藥，常用于治療心律失常和緩解急性或慢性疼痛。近年來，多項研究結(jié)果指出，利多卡因通過抑制癌細胞生長和轉(zhuǎn)移、誘導細胞凋亡，在乳腺癌、胃癌等人類惡性腫瘤中顯示出抗腫瘤潛力[3-4]。利多卡因通過增加宮頸癌細胞中長鏈非編碼RNA(lncRNA)MEG3表達水平，調(diào)節(jié)宮頸癌細胞活力和凋亡，進而抑制宮頸癌細胞生長[5]。有文獻報道，利多卡因以濃度依賴的方式抑制膀胱癌細胞增殖，利多卡因和絲裂霉素C的聯(lián)合應(yīng)用可以延長荷瘤小鼠的生存期[6]。然而，利多卡因?qū)Π螂装┘毎蛲?、遷移前侵襲的影響和機制仍未闡明。lncRNA DNA損傷檢測點介質(zhì)1反義RNA(MDC1-AS)是近年來發(fā)現(xiàn)的膀胱癌抑癌lncRNA，研究結(jié)果指出，恢復膀胱癌中MDC1-AS表達水平，可顯著降低膀胱癌細胞的遷移和侵襲能力[7]。本研究通過分析利多卡因?qū)Π螂装┘毎鸗24凋亡、遷移和侵襲以及對MDC1-AS表達的影響，探討其抗腫瘤作用是否與調(diào)控MDC1-AS表達有關(guān)，以期為利多卡因在膀胱癌治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；CytoFLEX型流式細胞儀(美國BECKMAN公司)。

1.2 藥品與試劑

鹽酸利多卡因注射液(山西晉新雙鶴藥業(yè),批準文號為國藥準字H11022295，規(guī)格為10 ml∶0.2 g，批號為20151102)；MDC1-AS過表達質(zhì)粒(pcDNA-MDC1-AS)及其對照(pcDNA)、MDC1-AS小干擾RNA(si-MDC1-AS)及其對照(si-NC)購自廣州銳博生物；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)試劑盒購于北京全式金生物；Transwell小室和基質(zhì)膠購自美國康寧公司；兔源B細胞淋巴瘤(Bcl-2)和Bcl相關(guān)x蛋白(Bax)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體以及羊抗兔IgG二抗購自上海賽信通公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix購于北京天根生化公司。

1.3 實驗細胞

膀胱癌細胞T24購于美國ATCC公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組

T24細胞在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的濕潤培養(yǎng)箱中用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的杜爾伯格伊戈爾培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)。采用含1.25、2.5及5 mg/ml利多卡因[6]的培養(yǎng)液孵育T24細胞2 h，分別命名為利多卡因1.25 mg/ml組、利多卡因2.5 mg/ml組以及利多卡因5 mg/ml組，以正常培養(yǎng)的T24細胞作為對照。參照下述實驗方法檢測細胞凋亡、遷移、侵襲以及MDC1-AS表達：為探討利多卡因是否通過調(diào)控MDC1-AS表達進而影響T24細胞凋亡、遷移和侵襲，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2 000分別轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-MDC1-AS、si-NC及si-MDC1-AS至對數(shù)期T24細胞；轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-MDC1-AS細胞分別記為pcDNA組、pcDNA-MDC1-AS組；用含5 mg/ml利多卡因的培養(yǎng)液孵育轉(zhuǎn)染si-NC、si-MDC1-AS的T24細胞2 h，分別記為利多卡因5 mg/ml+si-NC組、利多卡因5 mg/ml+si-MDC1-AS組。

2.2 流式細胞術(shù)分析細胞凋亡

將各組細胞重懸于結(jié)合緩沖液100 μl中，分別添加Annexin V-FITC 10 μl、PI 5 μl，在室溫(25 ℃)下于黑暗環(huán)境中孵育30 min后，補加結(jié)合緩沖液400 μl。采用流式細胞儀分析細胞凋亡(Annexin-V染色陽性)情況。

2.3 Transwell實驗分析細胞遷移和侵襲

向24孔板下室中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基500 μl，向未涂抹(遷移)或涂抹(侵襲)Transwell上腔室中加入無血清培養(yǎng)基稀釋的單細胞懸液200 μl(細胞數(shù)約為1×105個)。培養(yǎng)24 h后，以棉簽去除Transwell上腔室膜表面細胞，用4%多聚甲醛固定下室膜表面細胞。結(jié)晶紫染色后顯微鏡下觀察細胞過膜情況，以5個隨機視野的細胞數(shù)均值表示細胞遷移或侵襲能力。

2.4 免疫印跡法(Western blot)分析Bcl-2和Bax蛋白表達

RIPA裂解緩沖液裂解細胞。離心去除細胞碎片，并用BCA法分析蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳將等量蛋白分離，并用轉(zhuǎn)膜裝置將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。室溫下，按照5%脫脂牛奶孵育1 h，第一抗體(1∶ 1 000稀釋)孵育2 h，第二抗體(1∶ 2 000稀釋)孵育1 h進行免疫印記。電化學發(fā)光法顯色后，通過Quantity One軟件分析各條帶灰度值，目的蛋白表達水平以對應(yīng)蛋白和內(nèi)參GAPDH灰度值表示。

2.5 實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription q quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測MDC1-AS表達量

TRIzol試劑分析細胞中總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將2 μg的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再用SYBR Green PCR Master Mix進行RT-qPCR。MDC1-AS表達量采用2-ΔΔCT法計算。MDC1-AS上游引物5′-TCCCAGATGTGCCAAAGTCAG-3′，下游引物5′-AGCAACCCCAGTTGTCATT C-3′；GAPDH上游引物5′-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3′，下游引物5′-GGGGTCATTG ATGGCAACAATA-3′。

2.6 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 利多卡因?qū)24凋亡的影響

與對照組比較，2.5、5 mg/ml的利多卡因干預后T24細胞凋亡率、Bax蛋白表達顯著升高，Bcl-2蛋白表達量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；不同劑量利多卡因組T24細胞凋亡率、Bcl-2和Bax蛋白表達量比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 利多卡因誘導T24凋亡及對蛋白表達的影響Tab 1 Apoptosis of T24 induced by lidocaine and its effect on protein expression

圖1 利多卡因誘導T24凋亡及對蛋白表達的影響Fig 1 Apoptosis of T24 induced by lidocaine and its effect on protein expression

3.2 利多卡因?qū)24遷移侵襲的影響

與對照組比較，2.5、5 mg/ml的利多卡因干預后T24細胞遷移和侵襲細胞數(shù)顯著減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；不同劑量利多卡因組T24細胞遷移和侵襲細胞數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2、圖2。

圖2 利多卡因抑制T24遷移、侵襲圖Fig 2 Inhibitors of T24 migration and invasion by lidocaine

表2 T24細胞遷移和侵襲細胞數(shù)個，n=3)Tab 2 Number of T24 cell migration and invasion

3.3 利多卡因?qū)24中MDC1-AS表達的影響

與對照組比較，2.5、5 mg/ml的利多卡因干預后T24細胞中MDC1-AS表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；不同劑量利多卡因組T24細胞MDC1-AS表達量比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 利多卡因促進MDC1-AS的表達Tab 3 Promotion of expression of MDC1-AS by lidocaine

3.4 過表達MDC1-AS對T24凋亡、遷移和侵襲的影響

與pcDNA組比較，pcDNA-MDC1-AS組T24細胞中MDC1-AS表達量顯著升高，細胞凋亡率、Bax蛋白表達量顯著升高，遷移和侵襲細胞數(shù)、Bcl-2蛋白表達量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4、圖3。

表4 過表達MDC1-AS誘導T24凋亡、遷移和侵襲Tab 4 Apoptosis, migration and invasion of T24 induced by over-expression of n=3)

3.5 干擾MDC1-AS對利多卡因處理的T24凋亡、遷移和侵襲的影響

與利多卡因5 mg/ml+si-NC組比較，利多卡因5 mg/ml+si-MDC1-AS組T24細胞中MDC1-AS表達量顯著降低，細胞凋亡率、Bax蛋白表達量顯著降低，遷移和侵襲細胞數(shù)、Bcl-2蛋白表達量顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表5、圖4。

A.過表達MDC1-AS對T24凋亡的影響；B.過表達MDC1-AS對T24遷移的影響；C.過表達MDC1-AS對T24侵襲的影響A.effect of MDC1-AS overexpression on the apoptosis of T24；B.effect of MDC1-AS overexpression on the migration of T24；C.effect of MDC1-AS overexpression on the invasion of T24圖3 過表達MDC1-AS誘導T24凋亡、遷移和侵襲及對凋亡蛋白表達的影響Fig 3 Apoptosis, migration and invasion of T24 induced by over-expression of MDC1-AS and its effect on expression of apoptotic protein

表5 干擾MDC1-AS減弱利多卡因處理的T24凋亡、遷移和侵襲的作用Tab 5 Attenuation of role of interference with MDC1-AS on migration, invasion and expression of apoptotic proteins of T24 cells induced by lidocaine n=3)

A.干擾MDC1-AS減弱利多卡因處理對T24凋亡的影響；B.干擾MDC1-AS減弱利多卡因處理對T24遷移的影響；C.干擾MDC1-AS減弱利多卡因處理對T24侵襲的影響A.interfering with MDC1-AS attenuates the effect of lidocaine treatment on T24 apoptosis；B.interfering with MDC1-AS attenuates the effect of lidocaine treatment on T24 migration；C.interfering with MDC1-AS attenuates the effect of lidocaine treatment on T24 invasion圖4 干擾MDC1-AS減弱利多卡因處理的T24凋亡、遷移和侵襲及凋亡蛋白表達的影響Fig 4 Attenuation of effect of interference with MDC1-AS on migration, invasion and expression of apoptotic proteins of T24 cells induced by lidocaine

4 討論

近年來，多項研究結(jié)果指出，利多卡因可抑制多種惡性腫瘤細胞的惡性生物學行為，進而降低腫瘤切除術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移復發(fā)的可能性[8-9]。利多卡因可通過誘導細胞周期阻滯降低肺癌細胞增殖能力[10]；通過下調(diào)瞬時受體電位陽離子通道亞家族V成員6(TRPV6)表達抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲[11]。在胃癌中，利多卡因?qū)盒阅[瘤細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用與上調(diào)miR-145表達有關(guān)[12]。與上述抗腫瘤作用一致，本研究結(jié)果顯示，利多卡因(2.5、5 mg/ml)可顯著抑制膀胱癌細胞T24的遷移和侵襲能力，增加細胞凋亡率，并呈劑量依賴效應(yīng)。Bax和Bcl-2是線粒體調(diào)控途徑中的重要基因，Bax是細胞凋亡的啟動子，當Bax表達過量時Bax同型二聚體大量形成促進細胞凋亡。研究結(jié)果指出，lncRNA通過下調(diào)Bax表達、上調(diào)Bcl-2表達可抑制膀胱癌細胞凋亡[13]。利多卡因通過增加Bax蛋白、下調(diào)Bcl-2表達誘導肝癌細胞凋亡[14]。與上述發(fā)現(xiàn)一致，本研究中，利多卡因可顯著下調(diào)T24細胞中Bcl-2表達、上調(diào)Bax表達，表明利多卡因可能通過調(diào)控線粒體途徑對T24細胞發(fā)揮促凋亡作用。上述研究結(jié)果表明，利多卡因通過抑制T24細胞遷移和侵襲，增加細胞凋亡，在膀胱癌中具有抗腫瘤作用。

lncRNA是一類蛋白編碼能力有限或缺失的RNA轉(zhuǎn)錄本，其通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)或染色質(zhì)修飾等多種途徑調(diào)控基因表達在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮作用。MDC1是DNA損傷機制的關(guān)鍵組成部分，參與細胞對DNA損傷的早期反應(yīng)以保護基因組完整性。MDC1-AS是MDC1的反義lncRNA，研究結(jié)果指出，膠質(zhì)瘤組織中MDC1-AS表達水平較正常腦組織顯著下調(diào)，且膠質(zhì)瘤細胞中MDC1-AS也呈低表達，上調(diào)MDC1-AS表達可顯著抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖和周期進展[15]。此外，MDC1-AS過表達通過MDC1依賴機制抑制人胃癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[16]。本研究探討了MDC1-AS在膀胱癌中的作用，發(fā)現(xiàn)過表達MDC1-AS可顯著上調(diào)Bax表達，下調(diào)Bcl-2，抑制T24細胞遷移和侵襲，并促進細胞凋亡。既往研究結(jié)果顯示，在宮頸癌[5]、肝癌[17]、肺癌[18]、胃癌[19]以及視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞瘤[20]中，利多卡因的抗腫瘤作用多與調(diào)控lncRNA、miRNA表達有關(guān)，但利多卡因是否通過調(diào)控MDC1-AS表達而影響T24細胞遷移、侵襲和凋亡并未可知。本研究中，經(jīng)利多卡因(2.5、5 mg/ml)處理后，T24細胞中MDC1-AS表達量以劑量依賴方式增加；而轉(zhuǎn)染si-MDC1-AS干擾MDC1-AS表達顯著減弱利多卡因(5 mg/ml)處理對T24細胞的抗遷移、抗侵襲和促凋亡作用，恢復T24細胞遷移、侵襲能力和凋亡水平，這說明上調(diào)MDC1-AS表達是利多卡因在膀胱癌中發(fā)揮抗腫瘤作用的重要機制。然而，本研究仍存在不足之處，是否存在其他lncRNA參與利多卡因?qū)Π螂装┘毎飳W行為的調(diào)控值得探討；此外，MDC1-AS的下游靶miRNA需進一步確認。

綜上所述，本研究證實了利多卡因可抑制膀胱癌細胞遷移、遷移，誘導細胞凋亡，其機制與上調(diào)MDC1-AS表達有關(guān)，初步揭示了利多卡因在膀胱癌中的抗腫瘤機制，為利多卡因在膀胱癌治療中的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。