周 潔 徐 攀 胡軼娟 樓柯浪 吳曉俊 梁衛(wèi)青 張宏建 浦錦寶#

1 浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江 杭州 310007

2 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

前胡為傘形科植物白花前胡Peucedanum praeruptorum Dunn的干燥根。主要分布安徽、浙江、貴州、云南、四川等地?！侗静輩R言》一書(shū)[1]中提到，“前胡，散風(fēng)寒、凈表邪、溫肺氣、消痰嗽之藥也。如傷風(fēng)之證，咳嗽痰喘，聲重氣盛，此邪在肺經(jīng)也?！倍鴵?jù)《本草綱目》記載，前胡“清肺熱，化痰熱，散風(fēng)邪”[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其具有降氣化痰，宣散風(fēng)熱的功效，可用于肺氣不降所致的痰熱喘滿(mǎn)，咯痰黃稠，風(fēng)熱咳嗽痰多。前胡在臨床上治療氣道炎癥有較好的療效[3]，但其對(duì)H2O2處理氧化應(yīng)激刺激下增殖影響未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

氧化應(yīng)激與氣道炎癥關(guān)系密切，氣道炎癥能促進(jìn)氣道重塑，而氣道重塑中，氣道平滑肌細(xì)胞的增生有著重要的作用[4]。研究表明，氧化應(yīng)激可刺激支氣管平滑肌細(xì)胞（HBSMSCs）增殖，進(jìn)而導(dǎo)致氣道炎癥的發(fā)生和加重[5-6]。H2O2是一種體內(nèi)氧自由基，屬于活性氧家族成員之一。利用不同濃度H2O2刺激離體HBSMSCs的方法能近似地模擬自然狀態(tài)下氣道炎癥的氧化應(yīng)激狀態(tài)[7]。氣道炎癥與氧化應(yīng)激反應(yīng)關(guān)系密切，氧自由基可激活NF-κB及某些細(xì)胞因子(如IL-8)等，對(duì)機(jī)體組織細(xì)胞產(chǎn)生氧化作用，這在氣道炎癥的發(fā)病機(jī)制中已得到廣泛的認(rèn)可[8]。

本研究在離體的人源支氣管平滑肌細(xì)胞上，予不同濃度H2O2刺激不同時(shí)間的方法形成體外氧化應(yīng)激模型。HBSMC經(jīng)H2O2刺激后可以使細(xì)胞增殖率增加，由此可確定體外氧化應(yīng)激模型造模成功。觀察H2O2處理氧化應(yīng)激刺激后，用前胡有效成分及不同產(chǎn)地前胡粗提物干預(yù)后支氣管平滑肌細(xì)胞增殖影響。

1 儀器與試劑

1.1 試劑：RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清（Hyclone公司）；CCK-8、DMSO（Sigma公司）；0.25%胰蛋白酶EDTA、PBS緩沖液、1%青鏈霉素（Gibco公司）；10cm培養(yǎng)皿、96孔培養(yǎng)板（Corning公司）。

1.2 儀器：ELX800酶標(biāo)儀（BioTek公司）；超凈工作臺(tái)（江蘇省蘇州凈化設(shè)備公司）；CO2培養(yǎng)箱、-80℃超低溫冰箱（Thermo公司）；倒置顯微鏡及數(shù)碼攝像裝置（Nikon公司）；4℃低溫離心機(jī)（Eppendorf公司）。

1.3 樣品采集：采集產(chǎn)于浙江（磐安、淳安、臨安）、安徽、湖南、湖北、四川、云南、山東、江西、貴州、重慶等12地的白花前胡栽培新鮮藥材，自然陰干后用于前胡藥材有效成分含量（白花前胡甲素、乙素）的測(cè)定，樣品信息見(jiàn)表1。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：購(gòu)買(mǎi)人支氣管平滑肌細(xì)胞HBSMCs復(fù)蘇傳代培養(yǎng)，2～8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。于RPMI-1640培養(yǎng)液（含10%FBS）的10cm皿中正常傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度為37℃，CO2濃度為5%。

2.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖：向96孔板中接種5000個(gè)細(xì)胞/孔，分別用不同濃度的供試品孵育細(xì)胞，再向每孔細(xì)胞中加入10μl CCK-8試劑，37℃生化培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育3h，最后利用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定細(xì)胞吸光度值來(lái)檢測(cè)細(xì)胞增殖活力。

2.3 不同產(chǎn)地前胡提取物中白花前胡甲素和乙素含量的測(cè)定：稱(chēng)取不同產(chǎn)地前胡干燥粉末各0.5g，加入25ml甲醇超聲提取30min，減壓揮干后，再用DMSO分別溶解稀釋前胡提取物至125、250、500μg/ml，測(cè)定12個(gè)產(chǎn)地中前胡提取物中白花前胡甲素和乙素的含量。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 不同產(chǎn)地前胡中白花前胡甲素和乙素含量：不同產(chǎn)地中前胡白花前胡甲素和乙素含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)下表1。從表中可知，各產(chǎn)地之間的白花前胡甲素和乙素含量有較大差異，分別在14.43～22.45mg/g和0.82～6.71mg/g之間。而根據(jù)國(guó)家藥典規(guī)定白花前胡甲素和乙素含量不得低于0.9%和0.24%，所有產(chǎn)地前胡中白花前胡甲素含量均超過(guò)藥典標(biāo)準(zhǔn)，部分產(chǎn)地的白花前胡乙素含量達(dá)不到藥典標(biāo)準(zhǔn)。其中野生前胡提取物中的白花前胡乙素含量遠(yuǎn)大于栽培前胡提取物的含量。

表1 不同產(chǎn)地前胡提取物中白花前胡甲素和白花前胡乙素含量

3.2 不同濃度H2O2作用不同時(shí)間下細(xì)胞增殖率CCK-8變化：如圖1所示，可觀察到在25、50μM濃度范圍內(nèi)，作用6h、12h后，0、25、50、100μM濃度H2O2作用組吸光度均無(wú)明顯差別；作用24h后，25、50μM濃度H2O2組吸光度較0μM高，在25μM H2O2作用24h時(shí)，吸光度值達(dá)到最大，增殖率最大。作用48h、72h后，25μM、50μM濃度H2O2組吸光度值仍較0μM濃度H2O2組高，50μM濃度H2O2組吸光度值較25μM濃度H2O2組為低。在200μM濃度H2O2作用6h后，細(xì)胞增殖率就開(kāi)始負(fù)增長(zhǎng)，且隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，負(fù)增長(zhǎng)率逐漸增大。

圖1 不同濃度作用HBSMC不同時(shí)間下細(xì)胞增殖率檢測(cè)

3.3 前胡中白花前胡甲素、白花前胡乙素對(duì)H2O2誘導(dǎo)支氣管平滑肌增殖的影響：向96孔板中接種2000個(gè)細(xì)胞/孔，據(jù)圖1中25μM H2O2作用24h細(xì)胞增值率最大作為對(duì)照，分別用不同濃度白花前胡甲素、白花前胡乙素分別進(jìn)行干預(yù)，24h后每孔加入10μlCCK-8在酶標(biāo)儀中450nm處檢測(cè)吸光值。

如圖2所示，白花前胡甲素在12.5、25、50μM濃度下對(duì)H2O2刺激HBSMSCs增殖有較明顯的抑制作用，且與空白對(duì)照0μM相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.001）。而白花前胡乙素對(duì)H2O2刺激HBSMSCs增殖的抑制作用較弱，其中12.5、25μM白花前胡乙素與0μM相比有一定的抑制作用，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 經(jīng)H2O2刺激后白花前胡甲素、白花前胡乙素對(duì)HBSMSCs增殖影響

3.4 不同產(chǎn)地前胡對(duì)H2O2誘導(dǎo)支氣管平滑肌增殖的影響：本實(shí)驗(yàn)組選取表1中白花前胡。于96孔板中接種HBSMSCs，加入25μMH2O2后分別用上述不同產(chǎn)地不同濃度白花前胡提取物進(jìn)行干預(yù)后，加入CCK-8試劑孵育后放入酶標(biāo)儀（450nm）進(jìn)行檢測(cè)。

如圖3所示，與control組相比，1～12不同產(chǎn)地供試品在125μg/mL濃度下對(duì)H2O2誘發(fā)的HBSMSCs增殖效應(yīng)均有抑制，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中1、2、3、8四個(gè)產(chǎn)地來(lái)源的白花前胡粗提物在125μg/ml抑制H2O2誘發(fā)的HBSMSCs增殖的效果較其他產(chǎn)地更佳（P＜0.001）。其次4、6、7、10在125μg/ml抑制H2O2誘發(fā)的HBSMSCs增殖的效果較control組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。而5、9、11、12四個(gè)產(chǎn)地的白花前胡提取物在抑制H2O2誘發(fā)的HBSMSCs增殖效果上較control組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但較其他8個(gè)產(chǎn)地效果稍差。隨濃度增高，1～12白花前胡抑制作用均較125μg/ml濃度減弱，其中1、8與control組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。其次為3與control組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。此外，2、12與control組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 不同產(chǎn)地前胡對(duì)H2O2誘導(dǎo)支氣管平滑肌增殖的影響

3.5 不同產(chǎn)地前胡提取物抑制平滑肌細(xì)胞增殖活性與其活性成分含量的相關(guān)性分析：在測(cè)定不同產(chǎn)地前胡提取物中白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量及其對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖抑制活性的基礎(chǔ)上，本研究還對(duì)兩者進(jìn)行了Person相關(guān)性分析（表2）。從表中相關(guān)系數(shù)來(lái)看，3種給藥濃度下白花前胡甲素與抑制平滑肌細(xì)胞增殖活性的相關(guān)系數(shù)均大于白花前胡乙素與抑制平滑肌細(xì)胞增殖活性的相關(guān)系數(shù)，這也與本研究中白花前胡甲素單體和白花前胡乙素單體對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖活性的抑制作用一致。

表2 不同產(chǎn)地前胡提取物抑制平滑肌細(xì)胞增殖活性與活性成分含量相關(guān)系數(shù)

4 討論

在不同濃度H2O2作用HBSMSCs不同時(shí)間考察中，25μM H2O2作用24h時(shí)，增殖率最大。白花前胡甲素在12.5、25、50μM濃度下對(duì)H2O2刺激HBSMSCs增殖有較明顯的抑制作用。而白花前胡乙素對(duì)H2O2刺激HBSMSCs增殖的抑制作用較弱，其中12.5、25μM白花前胡乙素與0μM相比有一定的抑制作用，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可得，在HBSMSCs氧化應(yīng)激引發(fā)的增殖過(guò)程中，白花前胡甲素相較于白花前胡乙素其抑制作用較為明顯。

本實(shí)驗(yàn)比較不同產(chǎn)地前胡對(duì)H2O2刺激HBSMSCs增殖抑制效果，發(fā)現(xiàn)來(lái)自浙江三個(gè)產(chǎn)地和安徽寧國(guó)四個(gè)產(chǎn)地的抑制作用最強(qiáng)，其次為貴州大方、江西九江、湖北利川和云南騰沖，而湖南華容、山東泰安、重慶巫溪和四川達(dá)州效果稍差。這也說(shuō)明了產(chǎn)自道地產(chǎn)區(qū)浙江和安徽的前胡藥材對(duì)于支氣管平滑肌細(xì)胞增殖有較好的抑制作用，具有較好的消除氣道炎癥的效果。

抑制平滑肌細(xì)胞增殖活性與前胡活性成分含量的相關(guān)性分析表明，前胡提取物抑制平滑肌細(xì)胞增殖活性與其活性成分白花前胡甲素和白花前胡乙素含量均呈正相關(guān)，與白花前胡乙素相比，白花前胡甲素與抑制平滑肌細(xì)胞增殖活性的相關(guān)性更強(qiáng)。

本研究立足本草經(jīng)典，與現(xiàn)代藥理研究結(jié)合，挖掘前胡在氧化應(yīng)激條件下對(duì)氣道炎癥的藥理作用，并通過(guò)不同產(chǎn)區(qū)前胡抗氣道炎癥活性比較，得出道地產(chǎn)區(qū)浙江和安徽兩地的前胡藥材較其他產(chǎn)區(qū)效果更佳，且相關(guān)性分析得出該生物學(xué)效應(yīng)與其活性成分前胡甲素、乙素含量呈正相關(guān)，該研究還為我國(guó)中醫(yī)理論現(xiàn)代化的發(fā)展提供有益的參考。