劉海娟,謝錦霞

(西安市人民醫(yī)院婦產科,西安 710068;*通訊作者,E-mail:13629267550@163.com)

宮頸癌是常發(fā)病于女性的惡性腫瘤之一,發(fā)病率及死亡率高,且不斷上升,嚴重威脅女性的健康,因此尋找新的宮頸癌治療和診斷的分子標志物對于其臨床具有重要意義[1,2]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長度大于200個核苷酸的RNA,隨著高通量測序技術的發(fā)展,越來越多的lncRNA被報道在腫瘤組織中差異表達,并可調控腫瘤的增殖、轉移及凋亡[3-5]。已有研究表明lncRNA HOXD-AS1在腫瘤的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,可調控神經(jīng)母膠質瘤、膀胱癌、前列腺癌[6-8],但是lncRNA HOXD-AS1在宮頸癌中的作用及調控機制尚無明確研究,本研究探究lncRNA HOXD-AS1對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響及機制,旨在為宮頸癌的臨床治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

人正常宮頸上皮細胞HCerEpic、人宮頸癌細胞HeLa和C33A購自中科院上海細胞庫;MTT試劑購自Amresssco公司;細胞凋亡檢測試劑盒(沈陽萬類生物技術有限公司);Lipofectamine 2000轉染試劑盒;雙熒光素酶基因載體及雙熒光素酶基因報告檢測試劑盒(漢恒生物技術有限公司);qPCR試劑盒、cDNA合成試劑盒購自福麥斯生物技術有限公司;B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bax蛋白、分裂半胱氨酸蛋白酶(cleaved Caspase-3)、細胞周期蛋白D1(cyclin D1)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)、磷酸化的PI3K(phospho-PI3K, p-PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,又稱AKT)、磷酸化的AKT(phospho-AKT, p-AKT)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)、磷酸化的mTOR(phospho-mTOR, p-mTOR)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)一抗,山羊抗兔二抗購自沈陽萬類生物技術有限公司,cDNA Synthesis試劑盒及PCR試劑盒購自福麥斯生物技術有限公司,流式細胞儀購自美國Beckman公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

HCerEpic細胞、HeLa和C33A細胞均復蘇并培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)至細胞匯合率達80%時,使用胰蛋白酶消化并傳代。

1.3 細胞轉染

取對數(shù)生長期的HeLa細胞接種于6孔板中,分為miR-133a-3p mimic組、negative control(NC)組和miR-133a-3p inhibitor組,每孔細胞數(shù)為1×105,根據(jù)轉染試劑盒說明書,分別將miR-133a-3p mimic、negative control(NC)、miR-133a-3p inhibitor與轉染試劑混合,然后在不含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中與HeLa細胞共孵育8 h,再用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后即獲得轉染細胞株。

將對數(shù)生長期的HeLa細胞接種至6孔板中,分為si-HOXD-AS1組和si-NC組,然后根據(jù)脂質體2000轉染試劑說明書分別轉染lncRNA HOXD-AS1 siRNA以及negative control,主要步驟為:HeLa細胞生長至70%時,按說明書將siRNA質粒與脂質體2000轉染試劑混合,室溫共孵育20 min后加入細胞培養(yǎng)基中,共孵育48 h后進行后即獲得轉染細胞株。

將對數(shù)生長期的HeLa細胞接種至6孔板中,分為si-NC組、si-HOXD-AS1組和si-HOXD-AS1+miR-133a-3p inhibitor組,si-NC組和si-HOXD-AS1組按照上述方法轉染negative control和lncRNA HOXD-AS1 siRNA,si-HOXD-AS1+miR-133a-3p inhibitor組細胞先轉染lncRNA HOXD-AS1 siRNA,再轉染miR-133a-3p inhibitor。

1.4 MTT法檢測細胞增殖能力

取si-NC組、si-HOXD-AS1組和si-HOXD-AS1+miR-133a-3p inhibitor組HeLa細胞接種至96孔板中,細胞密度為1×105/ml,每孔100 μl,細胞完全貼壁后,分別于24,48,72 h時每孔加入20 μl 5 mg/ml MTT溶液,于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h,然后吸除細胞培養(yǎng)液,每孔加入150 μl二甲亞砜溶液,于搖床上充分混勻,反應完全后,在酶標儀OD490 nm處檢測吸光度值,OD值越大細胞增殖能力越強。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡

分別取3×105個si-NC組、si-HOXD-AS1組、si-HOXD-AS1+miR-133a-3p inhibitor組HeLa細胞接種于6孔板中,每組3個復孔,根據(jù)細胞凋亡檢測試劑盒說明書,每孔取5×105個細胞于離心管中,用500 μl的Binding Buffer重懸細胞成單細胞懸液,而后添加5 μl的Annexin Ⅴ-FITC和5 μl的PI染料,混勻后室溫避光孵育15 min,并設置Annexin Ⅴ-FITC和PI單陽性管用于調熒光補償,空白管用于調電壓;使用流式細胞儀檢測上述各樣品的熒光值,使用FlowJo v5.573軟件分析細胞凋亡數(shù)。

1.6 雙熒光素酶基因報告實驗檢測HOXD-AS1對miR-133a-3p的調控作用

miRcode數(shù)據(jù)庫預測HOXD-AS1 3′UTR區(qū)域與miR-133a-3p結合位點,構建野生型(HOXD-AS1-WT)和突變型基因靶點的HOXD-AS1的3′UTR-熒光素酶表達載體(HOXD-AS1-MUT),然后按照1.3中轉染方法,將HOXD-AS1-WT和HOXD-AS1-MUT轉染至HeLa細胞,穩(wěn)定表達后,再將miR-133-3p mimic和miR-NC分別轉染至HOXD-AS1-WT和HOXD-AS1-MUT HeLa細胞,根據(jù)雙熒光素酶基因報告檢測試劑盒進行雙熒光素酶報告實驗,測定實驗重復3次。

1.7 qRT-PCR檢測HOXD-AS1的表達

使用Trizol提取RNA,具體步驟為:1×106個細胞加入1 ml Trizol裂解5 min,取上述細胞裂解液加入200 μl氯仿,靜置5 min后,于12 000g,4 ℃離心15 min,轉移上層水相,加入500 μl異丙醇,12 000g,4 ℃離心10 min,去上清,1 ml 75%乙醇清洗RNA沉淀后,20 μl RNA-free水重懸RNA沉淀,55 ℃水浴10 min,即為細胞中總RNA,使用核酸定量儀檢測總RNA含量。根據(jù)cDNA Synthesis試劑盒指示配制反應體系,將提取的細胞RNA逆轉為cDNA,然后利用核酸定量儀對cDNA進行定量。然后根據(jù)qPCR試劑盒指示配制反應體系,進行qPCR反應,采用GAPDH作為內參,反應后采用2-ΔΔCt法計算基因表達水平。引物序列見表1。

表1 HOXD-AS1、GAPDH引物序列

1.8 Western blot檢測Bcl-2、Cyclin D1、Bax、cleaved Caspase-3、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白表達水平

每組取3×105個細胞接種于6孔板中,細胞長滿后,每孔細胞加入120 μl的RIPA蛋白裂解液和1.2 μl PMSF蛋白酶抑制劑,冰上裂解30 min后,12 000 r/min,4 ℃離心10 min,取上清,即為細胞總蛋白。BCA蛋白定量后蛋白沸水浴加熱變性,然后進行SDS-PAGE凝膠電泳,轉膜,用5%的脫脂牛奶對聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜封閉2 h,然后以1 ∶1 000稀釋后的Bcl-2、Cyclin D1、Bax、cleaved Caspase-3、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、GAPDH一抗4 ℃孵育過夜,TBST洗膜后二抗室溫孵育1.5 h,再用TBST洗膜后按照ECL試劑盒說明書配制發(fā)光液,并將PVDF膜浸入發(fā)光液中反應30 s,曝光并拍照,用ImageJ軟件對曝光結果進行定量分析。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 lncRNA HOXD-AS1高表達于宮頸癌細胞

qRT-PCR檢測結果顯示,相比于人正常宮頸上皮細胞HCerEpic,宮頸癌細胞HeLa和C33A、SiHa、Caski中l(wèi)ncRNA HOXD-AS1表達均顯著升高(P<0.001),HeLa細胞中表達水平最高,在HeLa細胞中轉染siRNA抑制lncRNA HOXD-AS1表達(見圖1),用于后續(xù)研究。

2.2 lncRNA HOXD-AS1調控宮頸癌細胞增殖

MTT檢測細胞增殖結果顯示,相比于轉染si-NC的細胞,轉染si-HOXD-AS1表達后,HeLa細胞的增殖能力顯著下降(P<0.001,見圖2)。

與HCerEpic相比,* * * P <0.001與si-NC組相比,###P <0.001圖1 qRT-PCR檢測lncRNA HOXD-AS1的表達水平Figure 1 Expression of lncRNA HOXD-AS1 by qRT-PCR

與si-NC組相比,* * P <0.01,* * * P <0.001圖2 lncRNA HOXD-AS1對HeLa細胞增殖能力的影響Figure 2 Effect of lncRNA HOXD-AS1 on HeLa cell proli-feration

2.3 lncRNA HOXD-AS1調控宮頸癌細胞凋亡

流式細胞術檢測細胞凋亡結果顯示,轉染si-NC后HeLa細胞的凋亡率為(3.17±0.24)%,轉染si-HOXD-AS1后HeLa細胞的凋亡率為(25.70±0.25)%,si-HOXD-AS1組細胞凋亡顯著高于si-NC組(見圖3)。Western blot檢測凋亡相關蛋白表達結果顯示,相比于si-NC組,si-HOXD-AS1組抑凋亡蛋白Bcl-2和Cyclin D1表達顯著下調(P<0.01),促凋亡蛋白Bax、cleaved Caspase-3表達顯著增加(P<0.001,見圖4)。

2.4 lncRNA HOXD-AS1靶向miR-133a-3p

運用miRcode數(shù)據(jù)庫預測到miR-133a-3p與lncRNA HOXD-AS1 3′非翻譯區(qū)(3′Untranslated Regions,3′UTR)存在結合位點(見圖5)。雙熒光素酶活性檢測結果顯示,與miR-NC組相比,miR-133a-3p mimic組WT-HOXD-AS1細胞中熒光活性顯著降低(P<0.001,見圖6),MUT-HOXD-AS1細胞中熒光活性無顯著變化。qPCR檢測結果顯示,相比于si-NC組,si-HOXD-AS1組HeLa細胞中miR-133a-3p表達顯著增加(P<0.001,見圖7)。

圖3 lncRNA HOXD-AS1對HeLa細胞凋亡水平的影響Figure 3 Effect of lncRNA HOXD-AS1 on HeLa cell apoptosis

2.5 lncRNA HOXD-AS1靶向miR-133a-3p調控宮頸癌細胞增殖

MTT檢測結果顯示,在48 h和72 h,相比于si-NC組,si-HOXD-AS1組HeLa細胞的增殖能力顯著降低(P<0.001),而si-HOXD-AS1+miR-133a-3p inhibitor組細胞的增殖能力顯著高于si-HOXD-AS1組(P<0.01,見圖8)。

與si-NC組相比,* * * P <0.001圖4 lncRNA HOXD-AS1對HeLa細胞凋亡蛋白表達的影響Figure 4 Effect of lncRNA HOXD-AS1 on the expression of apoptotic proteins in HeLa cells

圖5 lncRNA HOXD-AS1與miR-133a-3p結合位點Figure 5 Binding site between lncRNA HOXD-AS1 and miR-133a-3p

與miR-NC組相比,* * * P <0.001圖6 雙熒光素酶基因報告實驗驗證lncRNA HOXD-AS1與miR-133a-3p的靶向關系Figure 6 Verification of the targeting relationship between lncRNA HOXD-AS1 and miR-133a-3p by dual luciferase gene report experiment

2.6 lncRNA HOXD-AS1靶向miR-133a-3p調控宮頸癌細胞凋亡

流式細胞術檢測結果顯示,轉染si-NC組細胞凋亡率為(10.30±0.39)%,si-HOXD-AS1組細胞凋亡率為(20.23±1.34)%,si-HOXD-AS1組顯著高于si-NC組(P<0.001);si-HOXD-AS1+miR-133a-3p inhibitor組細胞凋亡率為(13.3±0.50)%,顯著低于si-HOXD-AS1組(P<0.01,見圖9)。

與si-NC組相比,* * * P <0.001圖7 lncRNA HOXD-AS1對miR-133a-3p表達的影響Figure 7 Effect of lncRNA HOXD-AS1 on expression of miR-133a-3p

與si-NC組相比,* * * P <0.001;與si-HOXD-AS1組比較,###P <0.01圖8 lncRNA HOXD-AS1和miR-133a-3p對HeLa增殖的影響Figure 8 Effect of lncRNA HOXD-AS1 and miR-133a-3p on HeLa cell proliferation

與si-NC組相比,* * * P <0.001;與si-HOXD-AS1組比較,##P <0.01圖9 lncRNA HOXD-AS1和miR-133a-3p對HeLa凋亡的影響Figure 9 Effect of lncRNA HOXD-AS1 and miR-133a-3p on HeLa apoptosis

2.7 lncRNA HOXD-AS1靶向miR-133a-3p調控PI3K/AKT/mTOR信號通路

Western blot檢測結果顯示,相比于si-NC組,si-HOXD-AS1組細胞PI3K、AKT、mTOR磷酸化水平顯著降低(P<0.01);相比于si-HOXD-AS1組,si-HOXD-AS1+miR-133a-3p inhibitor組細胞PI3K、AKT、mTOR磷酸化水平顯著升高(P<0.01,見圖10)。

與si-NC組相比,* * * P <0.001;與si-HOXD-AS1組相比,##P <0.01,###P <0.001圖10 lncRNA HOXD-AS1和miR-133a-3p對PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響Figure 10 Effect of lncRNA HOXD-AS1and miR-133a-3p on PI3K/AKT/mTOR signaling pathway

3 討論

宮頸癌是一種常見的發(fā)病率高的女性惡性腫瘤,其發(fā)病機制復雜,治療效果有限。有研究表明,分子靶向藥物或可在腫瘤的治療中發(fā)揮作用[9],隨著高通量測序和基因芯片技術的發(fā)展,越來越多的非編碼RNA被發(fā)現(xiàn)在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮調控作用,lncRNA作為非編碼RNA的一種,是一種轉錄組的重要部分,功能復雜,可調控腫瘤等疾病的病理進程。研究表明,lncRNA可在腫瘤組織中差異表達,通過轉錄調控、表觀修飾調控基因的表達,進而影響腫瘤的生長、轉移、耐藥等[10-13]。lncRNA HOXD-AS1已經(jīng)被報道在多種腫瘤中發(fā)揮調控作用,Yang等[14]研究發(fā)現(xiàn),lncRNA HOXD-AS1能夠通過抑制HOXD3誘導的整聯(lián)蛋白β3轉錄激活和MAPK/AKT信號通路傳導調控大腸癌的生長和轉移。Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn),HOXD-AS1通過miR-608/FZD4軸促進卵巢癌的細胞增殖、遷移和侵襲。亦有研究表明[6-8],HOXD-AS1可作為神經(jīng)母膠質瘤轉移的生物標志物,亦可作為膀胱癌的治療靶點,也可調控前列腺癌的增殖以及化療耐藥性。HOXD-AS1對宮頸癌的影響尚未明確研究,本文探究了HOXD-AS1對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響及機制,旨在為宮頸癌的臨床治療提供幫助。

本研究通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)HOXD-AS1高表達于宮頸癌細胞HeLa和C33A,提示HOXD-AS1可能影響宮頸癌的病理進程。HOXD-AS1在HeLa細胞中表達最高,所以我們轉染siRNA抑制HeLa細胞中HOXD-AS1表達,結果發(fā)現(xiàn)抑制其表達后HeLa細胞增殖能力顯著下降,細胞凋亡水平顯著增加,抑凋亡蛋白Bcl-2和Cyclin D1表達顯著下調,促凋亡蛋白Bax、cleaved Caspase-3表達顯著增加,說明HOXD-AS1能夠影響宮頸癌細胞的生長,所以本文又進一步探究了HOXD-AS1調控宮頸癌增殖和凋亡水平的機制。

在哺乳動物中l(wèi)ncRNA多通過調控miRNA的表達而調控各種病理生理過程,研究表明[16,17],HOXD-AS1可通過調控miR-186-5p影響卵巢癌的進展,亦可通過調控miR-421表達調控乳腺癌進程。本研究通過miRcode數(shù)據(jù)庫預測到miR-133a-3p為HOXD-AS1靶向結合的miRNA,又通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證了二者的靶向關系,轉染siRNA抑制HOXD-AS1表達后發(fā)現(xiàn)miR-133a-3p表達上調,所以我們推測HOXD-AS1可通過調控miR-133a-5p表達促進宮頸癌的生長,并且同時抑制宮頸癌細胞HOXD-AS1和miR-133a-3p表達,HeLa細胞的增殖能力顯著增加,細胞凋亡水平顯著下調,進一步說明HOXD-AS1能夠通過靶向調控miR-133a-3p的表達影響HeLa細胞的增殖和細胞凋亡。

PI3K/AKT/mTOR信號通路是調控腫瘤生長和轉移的關鍵通路,已有研究表明,PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活可顯著抑制腫瘤細胞的凋亡,主要機制為PI3K/AKT/mTOR信號通路激活后可調控caspase家族蛋白如caspase-3、caspase-9的表達而抑制細胞凋亡;并且AKT激活后可磷酸化Bad的Ser136/Ser112殘基,Bad磷酸化后再與Bcl-2解聚,游離的Bcl-2可發(fā)揮抗凋亡的作用[18,19]。本研究發(fā)現(xiàn),HOXD-AS1能夠調控凋亡相關蛋白Bcl-2、Cyclin D1、Bax和cleaved Caspase-3表達,所以本文探究了HOXD-AS1對PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響,結果顯示,抑制HOXD-AS1表達后HeLa細胞中PI3K、AKT、mTOR磷酸化水平均顯著下調,而抑制HOXD-AS1表達的同時抑制miR-133a-3p的表達,PI3K、AKT、mTOR磷酸化水平亦被顯著上調,說明HOXD-AS1能夠通過靶向miR-133a-3p而影響PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活。

綜上所述,HOXD-AS1可促進宮頸癌細胞的增殖,抑制宮頸癌細胞凋亡,其機制為通過靶向miR-133a-3p影響PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活。