劉 敏,張 弘,程 豐,張茂娜,趙涓涓

(1 湖北省鄂州市中心血站,鄂州 436000;2 鄂州市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科;3 鄂州市中心醫(yī)院病理科;*通訊作者,E-mail:zhangh2316@sina.com)

乳腺癌是女性群體中最常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率逐年上升[1]。盡管乳腺癌的診斷和治療手段已有了很大的進(jìn)步,仍有眾多乳腺癌患者的預(yù)后較差[2]。乳腺癌細(xì)胞的快速增殖和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要原因[3]。尋找新的分子診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn),已成為乳腺癌研究領(lǐng)域的重要方向。在人體各個(gè)細(xì)胞中存在大量微小RNA(miRNA),其通過靶向結(jié)合靶基因信使RNA(mRNA)的3′非翻譯區(qū),降解靶基因mRNA或抑制其翻譯,負(fù)向調(diào)控靶基因的表達(dá)[4,5]。miRNA在細(xì)胞的分化、增殖、轉(zhuǎn)移、衰老、凋亡等生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用,參與調(diào)控包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)病與進(jìn)展[6,7]。miR-7156-3p是miRNA家族的重要一員,在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中異常低表達(dá),發(fā)揮抑癌基因的作用[8]。目前,關(guān)于miR-7156-3p在乳腺癌中的表達(dá)和調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究通過分析miR-7156-3p在乳腺癌患者血清和乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況,探討miR-7156-3p影響乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移的調(diào)控機(jī)制,以期為乳腺癌的診斷和治療提供新的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 血清樣本

收集2018年8月至2020年7月于鄂州市中心醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的乳腺癌患者術(shù)前血清樣本42例,以2019年2月至2019年10月于鄂州市中心醫(yī)院體檢中心的健康體檢者血清樣本42例作為對(duì)照。所有乳腺癌患者術(shù)前均未接受放療、化療或生物治療。血清儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱內(nèi)存貯。本研究經(jīng)鄂州市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過,所有患者及健康體檢者均簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞株及主要試劑

RAB1A野生型質(zhì)粒(RAB1A-WT)、RAB1A突變體質(zhì)粒(RAB1A-MUT)、miR-NC、miR-7156-3p模擬物購自廣州銳博生物科技有限公司;人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF10A和乳腺癌細(xì)胞株HCC1937、MCF7、MB-MDA-468、SKBR3、BT549購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清均購自美國Gibco公司。LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen公司;雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。qPCR引物由上海生物工程股份有限公司合成。qPCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒購自美國Sigma公司。Transwell小室購自美國Corning公司。GAPDH、RAB1A、E-cadherin、N-cadherin、Snail和Slug蛋白抗體購自英國Abcam公司(蛋白編號(hào)分別為ab8245、ab36839、ab76055、ab18203、ab53519和ab27568)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MCF10A和MB-MDA-468細(xì)胞,采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HCC1937、MCF7、SKBR3、BT549細(xì)胞,在含5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),胰酶消化并傳代。將對(duì)數(shù)生長期的HCC1937細(xì)胞平鋪于6孔板,當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)30%時(shí),將HCC1937細(xì)胞隨機(jī)分為miR-NC組和miR-7156-3p組,根據(jù)LipofectamineTM3000試劑說明書進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,分別轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-7156-3p模擬物。轉(zhuǎn)染48 h后,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 qPCR檢測血清或細(xì)胞中miR-7156-3p和RAB1A mRNA的表達(dá)

向待測血清或細(xì)胞中加入Trizol裂解液,分別提取總RNA,并進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。配制20 μl的qPCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增檢測。qPCR引物見表1。采用2-ΔΔCt分析計(jì)算miR-7156-3p或RAB1A mRNA的相對(duì)表達(dá)量。miR-7156-3p檢測以U6為內(nèi)參,RAB1A mRNA檢測以GAPDH為內(nèi)參。

表1 qPCR引物序列

1.5 MTT法檢測兩組HCC1937細(xì)胞增殖能力

采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整兩組HCC1937細(xì)胞密度為1.5×104個(gè)/ml,以150 μl/孔接種96孔板,每組4個(gè)復(fù)孔。分別在細(xì)胞貼壁1,2,3,4,5 d加入20 μl濃度為5 g/L的MTT試劑,培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h,棄上清,加入150 μl/孔的二甲基亞砜,振蕩保證晶體溶解,酶標(biāo)儀檢測兩組HCC1937細(xì)胞在490 nm波長處的吸光值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.6 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測兩組HCC1937細(xì)胞遷移能力

采用不含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整兩組HCC1937細(xì)胞密度為1.8×104個(gè)/ml,以200 μl/孔接種于Transwell小室上室,下室加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基600 μl,于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室上室,采用棉簽小心擦去未穿過的細(xì)胞。加入多聚甲醛進(jìn)行固定,加入結(jié)晶紫進(jìn)行染色,采用磷酸鹽緩沖液洗滌并晾干。于倒置顯微鏡下,每組隨機(jī)選取4個(gè)視野,計(jì)數(shù)穿過的細(xì)胞數(shù)并取平均值。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)4次。

1.7 生物信息學(xué)預(yù)測miR-7156-3p的靶基因

本研究以MicroT-CDS預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測miR-7156-3p可能的靶基因,以O(shè)ncoLnc預(yù)后分析網(wǎng)站分析其靶基因表達(dá)水平與乳腺癌患者生存期的關(guān)系。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)驗(yàn)證miR-7156-3p的靶基因

將對(duì)數(shù)生長期的HCC1937細(xì)胞隨機(jī)分為4組,分別共轉(zhuǎn)染RAB1A-WT+miR-NC、RAB1A-WT+miR-7156-3p、RAB1A-MUT+miR-NC和RAB1A-MUT+miR-7156-3p。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后,參照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒說明書,分析4組細(xì)胞的相對(duì)熒光酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.9 Western blotting檢測RAB1A及下游蛋白表達(dá)

向兩組HCC1937細(xì)胞加入裂解液充分裂解40 min,離心獲得細(xì)胞總蛋白。每組上樣50 μg至聚丙烯酰氨凝膠(SDS-PAGE),110 V恒壓電泳1.5 h。以200 mA恒流轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維膜。于5%脫脂牛奶中封閉2 h,加入一抗在冰箱內(nèi)孵育過夜,加入二抗在室溫孵育2 h。均勻滴加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑,在凝膠成像系統(tǒng)中顯影并拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,實(shí)驗(yàn)資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌患者血清miR-7156-3p的表達(dá)情況

qPCR檢測結(jié)果顯示,乳腺癌患者血清中miR-7156-3p的表達(dá)水平為1.48±0.49,低于健康體檢者(8.71±1.69),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見圖1)。

與健康體檢者相比,* * P <0.01圖1 乳腺癌患者血清miR-7156-3p的表達(dá)水平Figure 1 The expression level of miR-7156-3p in the serum of breast cancer patients

2.2 乳腺癌細(xì)胞株和人正常乳腺上皮細(xì)胞miR-7156-3p表達(dá)水平

qPCR檢測結(jié)果顯示,與正常乳腺上皮細(xì)胞MCF10A比較,乳腺癌細(xì)胞株HCC1937、MCF7、MB-MDA-468、SKBR3、BT549中miR-7156-3p的表達(dá)明顯降低(P<0.05),HCC1937細(xì)胞中的變化最為明顯(P<0.01,見圖2)。

與MCF10A細(xì)胞相比,* P <0.05,* * P <0.01圖2 乳腺癌細(xì)胞株和正常乳腺上皮細(xì)胞中miR-7156-3p的表達(dá)水平Figure 2 The miR-7156-3p expression in breast cancer cell lines and normal breast epithelial cells

2.3 miR-7156-3p轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證及各組HCC1937細(xì)胞中RAB1A mRNA的表達(dá)

miR-NC組和miR-7156-3p組HCC1937細(xì)胞中miR-7156-3p相對(duì)表達(dá)量分別為1.01±0.07和9.03±1.08,與miR-NC組相比,miR-7156-3p組HCC1937細(xì)胞中miR-7156-3p的表達(dá)顯著增加(P<0.01)。miR-NC組和miR-7156-3p組HCC1937細(xì)胞中RAB1A mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.01±0.08和0.25±0.05,與miR-NC組相比,miR-7156-3p組HCC1937細(xì)胞中RAB1A mRNA的表達(dá)明顯降低(P<0.01)。

2.4 過表達(dá)miR-7156-3p對(duì)HCC1937細(xì)胞增殖能力的影響

MTT檢測結(jié)果顯示,與miR-NC組相比,從2 d開始,miR-7156-3p組HCC1937細(xì)胞的增殖能力顯著下降(P<0.05,見圖3)。

2.5 過表達(dá)miR-7156-3p對(duì)HCC1937細(xì)胞遷移的影響

Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示,miR-NC組和miR-7156-3p組HCC1937細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)分別為147.80±16.30和58.87±12.14。與miR-NC組相比,過表達(dá)miR-7156-3p的HCC1937細(xì)胞遷移能力明顯下降(P<0.01,見圖4)。

與miR-NC組相比,* P <0.05,* * P <0.01圖3 過表達(dá)miR-7156-3p對(duì)HCC1937細(xì)胞增殖的影響Figure 3 Effect of miR-7156-3p overexpression on proliferation of HCC1937 cells

圖4 Transwell法檢測過表達(dá)miR-7156-3p對(duì)HCC1937細(xì)胞遷移的影響 (結(jié)晶紫染色,×100)Figure 4 Effect of miR-7156-3p overexpression on migration of HCC1937 cells by Transwell (crystal violet staining,×100)

2.6 miR-7156-3p與靶基因結(jié)合位點(diǎn)驗(yàn)證

MicroT-CDS預(yù)測網(wǎng)站顯示,miR-7156-3p可能的靶基因是RAB1A(見圖5)。OncoLnc預(yù)后分析網(wǎng)站顯示,RAB1A表達(dá)水平較低的乳腺癌患者生存期較長(P<0.05,見圖6)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)顯示,相比miR-NC,miR-7156-3p可明顯下調(diào)RAB1A-WT質(zhì)粒的報(bào)告熒光強(qiáng)度(P<0.01,見圖7);對(duì)預(yù)測結(jié)合部位行突變處理后,相比miR-NC,miR-7156-3p不能抑制RAB1A-MUT質(zhì)粒的報(bào)告熒光強(qiáng)度(P>0.05,見圖7),表明miR-7156-3p的靶基因是RAB1A。

2.7 過表達(dá)miR-7156-3p對(duì)RAB1A蛋白及下游蛋白表達(dá)的影響

圖5 miR-7156-3p與RAB1A-WT和RAB1A-MUT結(jié)合預(yù)測圖Figure 5 The predicted map of miR-7156-3p binding to RAB1A-WT and RAB1A-MUT

Western blotting結(jié)果顯示,與miR-NC組相比,轉(zhuǎn)染miR-7156-3p后,RAB1A蛋白表達(dá)明顯降低,AKT蛋白的磷酸化程度明顯降低,AKT下游蛋白mTOR的表達(dá)明顯降低(見圖8)。

圖6 RAB1A表達(dá)水平與乳腺癌患者生存期的關(guān)系Figure 6 Relationship between the expression level of RAB1A and the survival time of breast cancer patients

與miR-NC相比,* * P <0.01圖7 雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證miR-7156-3p與RAB1A之間的靶向結(jié)合Figure 7 The dual luciferase reporter system verified the targeted binding between miR-7156-3p and RAB1A

與miR-NC組相比,* P <0.05,* * P <0.01圖8 Western blotting檢測miR-7156-3p對(duì)RAB1A蛋白及下游蛋白表達(dá)的影響Figure 8 Effect of miR-7156-3p on the expression of RAB1A protein and downstream proteins by Western blotting

3 討論

miRNA在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要調(diào)控作用[9,10]。近年來,越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中異常表達(dá),負(fù)責(zé)調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的各種惡性生物學(xué)行為[11,12]。Huang等[13]報(bào)道,miR-532-5p在乳腺癌組織中高表達(dá),下調(diào)miR-532-5p表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。Maimaitiming等[14]報(bào)道,與鄰近癌旁組織相比,乳腺癌組織樣品中miR-152的表達(dá)明顯下調(diào);過表達(dá)miR-152顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,ROCK1是miR-152在乳腺癌中的靶基因。有報(bào)道指出[8],神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中miR-7156-3p的表達(dá)顯著下調(diào),miR-7156-3p下降水平與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的生存率密切相關(guān),抑制miR-7156-3p表達(dá)可有效刺激神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和生長,增強(qiáng)miR-7156-3p表達(dá)可抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和生長。本研究篩選出miR-7156-3p低表達(dá)最顯著的HCC1937細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),通過轉(zhuǎn)染miR-7156-3p成功上調(diào)miR-7156-3p的表達(dá)后,HCC1937細(xì)胞的增殖和遷移能力明顯降低,表明miR-7156-3p在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌基因的作用。

通過生物信息學(xué)方法預(yù)測顯示,miR-7156-3p與Ras相關(guān)蛋白R(shí)ab-1A(Ras-related protein Rab-1A,RAB1A) mRNA的3′非翻譯區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn),RAB1A可能是其靶基因。RAB1A蛋白屬于Rab蛋白家族成員,參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo),影響細(xì)胞囊泡運(yùn)輸和膜轉(zhuǎn)運(yùn)等過程[15,16]。有報(bào)道顯示,RAB1A在結(jié)直腸癌、肺癌、胃癌、膀胱癌等惡性腫瘤中異常高表達(dá),與腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分期正相關(guān)[17,18]。RAB1A在乳腺癌組織中高表達(dá),抑制RAB1A表達(dá)可降低乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力[19]。本研究通過OncoLnc預(yù)后分析顯示,RAB1A表達(dá)水平較低的乳腺癌患者生存期較長。通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)證實(shí),RAB1A是miR-7156-3p的靶基因。qPCR和Western blotting檢測結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)miR-7156-3p可負(fù)向調(diào)控RAB1A的表達(dá)。RAB1A主要通過促進(jìn)AKT蛋白的磷酸化發(fā)揮癌基因作用[20]。Western blotting檢測結(jié)果顯示,miR-7156-3p降低RAB1A表達(dá)后,AKT蛋白的磷酸化程度明顯降低,其下游蛋白mTOR的表達(dá)明顯降低。

綜上所述,miR-7156-3p在乳腺癌患者血清及乳腺癌細(xì)胞株中低表達(dá),過表達(dá)miR-7156-3p可通過靶向調(diào)控RAB1A基因的表達(dá),降低AKT蛋白的磷酸化,抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。本研究為miR-7156-3p作為乳腺癌診斷和治療的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。