?；⒘?房國棟,萬 永,劉司南,張靖垚,耿西林*

(1 西安交通大學第三附屬醫(yī)院肝膽外科,西安 710068;2 西北工業(yè)大學附屬醫(yī)院肝膽外科;3 西安交通大學第三附屬醫(yī)院病理科;4 西安交通大學第一附屬醫(yī)院肝膽外科;*通訊作者,E-mail:gengxilin-xa@163.com)

對乙酰氨基酚(acetaminophen, APAP)是一種臨床上廣泛應用的解熱鎮(zhèn)痛藥,治療劑量下APAP安全可靠[1]。近年來,由其過量或不當應用引發(fā)的肝臟毒性損傷正呈上升趨勢,成為藥物誘導肝損傷及急性肝功能衰竭的主要原因[2]。據(jù)統(tǒng)計在美國約一半的急性肝衰竭是由APAP服用過量引起的,我國急性藥物性肝損傷住院患者也逐年遞增[2]。臨床上有洗胃、APAP解毒劑應用、營養(yǎng)支持等治療方式,嚴重者考慮肝移植。現(xiàn)有研究結(jié)果表明,高劑量的APAP會使葡萄糖醛酸化和硫酸化途徑飽和,產(chǎn)生過量的NAPQI[3],超出體內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)系統(tǒng)的清除能力,從而反應性增加活性氧(reactive oxygen species, ROS)的積累,觸發(fā)c-Jun-N端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)的磷酸化,JNK的持續(xù)激活在APAP誘導肝細胞死亡中起到核心作用[4]。

二甲雙胍(metformin, MET)是目前臨床常用的治療2型糖尿病的藥物之一。近年來的研究還發(fā)現(xiàn)MET可用于多囊卵巢綜合征、肥胖、心力衰竭和高血壓等疾病的治療[5]。同時,有報道稱MET對非酒精性脂肪性肝炎、酒精性脂肪肝、CCl4或甲氨蝶呤引起的肝中毒反應均有保護作用[5-9]。但是,MET對APAP誘發(fā)的急性藥物性肝損傷是否發(fā)揮保護作用尚待研究。

本研究中,我們應用APAP肝損傷動物模型,研究了MET對APAP誘導的急性肝損傷的保護作用,并初步探索了這種保護作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

6-8周C57BL/6雄性小鼠由陜西省人民醫(yī)院實驗中心提供。二甲雙胍(格華止,國藥準字H20023371),由上海施貴寶制藥有限公司提供。JNK羊抗鼠單克隆抗體和p-JNK羊抗鼠單克隆抗體由北京博奧森生物技術有限公司提供;TNF-α和IL-6檢測試劑盒由深圳達科為生物技術有限公司提供。RIPA裂解液由上海碧云天生物技術有限公司提供。APAP溶液的配制(將0.7 g APAP粉劑溶于100 ml生理鹽水中,在40 ℃水浴鍋中晃動充分溶解、混勻,按350 mg/kg劑量給藥準備)。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制作和實驗分組 6-8周齡BALB/c雄性小鼠(22-25 g)30只隨機平均分為3組:①空白對照組(control組);②藥物性肝損傷組(APAP組),腹腔內(nèi)注射350 mg/kg APAP溶液,作用24 h;③二甲雙胍處理組(APAP+MET組),于APAP暴露前30 min腹腔注射MET 400 mg/kg,后給予APAP溶液,作用24 h;各組小鼠均在APAP暴露24 h后處死,及時采集血液樣本和肝組織樣本。

1.2.2 血清ALT、AST水平的測定 根據(jù)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)檢測試劑盒,測定血清ALT、AST水平。

1.2.3 肝組織病理學檢查 取出分離后的肝臟組織利用4%甲醛溶液固定,常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色,觀察肝組織病理學改變。

1.2.4 炎癥相關因子的測定 根據(jù)ELISA檢測試劑盒說明書指示,測定血清TNF-α、IL-6含量。

1.2.5 c-Jun-N端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)的表達測定 精密稱取各組小鼠肝組織,根據(jù)RIPA裂解液使用說明書制備肝組織勻漿,肝組織與RIPA裂解液的比例為1 mg ∶7.5μl,用玻璃勻漿器上下、旋轉(zhuǎn)充分碾磨。在冰上裂解25 min后,14 000g離心30 min,取上清,利用Western blot檢測各組小鼠肝組織p-JNK/JNK(稀釋比1 ∶800)表達的變化,應用β-actin作為內(nèi)參校正。

2 結(jié)果

2.1 MET對APAP誘導急性肝損傷小鼠AST、ALT的影響

與對照組相比,APAP組小鼠血清AST和ALT水平顯著升高,差異均有統(tǒng)計學意義(t分別為19.95,11. 16,均P<0.05)。而APAP+MET組AST、ALT水平明顯低于APAP組,差異均有統(tǒng)計學意義(t分別為12.31,12.83,P<0.05,見圖1)。

2.2 MET對APAP誘導急性肝損傷肝組織病理改變的影響

與對照組相比,APAP誘導肝損傷小鼠肝組織內(nèi)可見肝小葉結(jié)構(gòu)模糊,肝索排列紊亂,形態(tài)失常,肝竇內(nèi)多發(fā)炎性細胞浸潤,正常的肝組織結(jié)構(gòu)明顯破壞;而上述改變在APAP+MET組小鼠中得到緩解(見圖2)。

2.3 MET對APAP誘導急性肝損傷炎癥因子水平的影響

用ELISA法檢測各組小鼠的TNF-α和IL-6的水平,結(jié)果顯示,APAP組TNF-α和IL-6水平均較空白對照組明顯升高,差異均有統(tǒng)計學意義(t分別為27.97,8.25,均P<0.05);相較于APAP組,APAP+MET組TNF-α和IL-6水平明顯下降,差異均有統(tǒng)計學意義(t分別為16.20,11.44,均P<0.05,見圖3)。

與空白對照組比,* P <0.05;與APAP組相比,#P <0.05圖1 MET處理對APAP誘導急性肝損傷AST、ALT的影響Figure 1 Effect of MET on AST and ALT levels in APAP-induced acute liver injury mice

圖2 MET處理對APAP誘導急性肝損傷肝組織病理改變的影響 (HE染色,×200)Figure 2 Effect of MET on pathological changes in APAP-induced acute liver injury mice (HE staining,×200)

與空白對照組相比,* P <0.05;與APAP組相比,#P <0.05圖3 MET處理對APAP誘導急性肝損傷血清TNF-α和IL-6水平的影響Figure 3 Effect of MET on the serum TNF-α and IL-6 levels in APAP-induced acute liver injury mice

2.4 MET通過減少JNK磷酸化減輕APAP致肝損傷

用Western blot法檢測小鼠肝組織勻漿內(nèi)p-JNK、JNK的表達,應用β-actin內(nèi)參校正后,空白對照組、APAP組和APAP+MET組肝組織內(nèi)JNK含量差異無統(tǒng)計學意義。與空白對照組相比,APAP組肝組織內(nèi)p-JNK含量明顯增多,差異有統(tǒng)計學意義(t=9.49,P<0.05);而APAP+MET組小鼠肝組織內(nèi)p-JNK含量較APAP組明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(t=8.79,P<0.05,見圖4)。

與對照組相比,* P <0.05;與APAP組相比,#P <0.05圖4 MET對APAP致肝損傷小鼠p-JNK/JNK的影響Figure 4 Effect of MET on the expression of p-JNK/JNK in liver tissue

3 討論

肝臟是藥物在人體中代謝和清除的部位,藥物導致的肝損傷近年來備受關注。APAP作為其中被研究最多的藥物之一,其過量攝入可導致嚴重的肝臟損傷,甚至急性肝衰竭[1]?，F(xiàn)有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)APAP誘導的小鼠急性肝損傷模型中,壞死的肝細胞釋放損傷相關分子模式(damage-associated mole-cular patterns, DAMPs),DAMPs則可被肝內(nèi)中性粒細胞等識別,并使得這些炎性細胞被激活[10],進一步釋放各種炎性因子如TNF-α和IL-6,從而加重炎癥反應及細胞損傷。炎癥反應被認為是APAP致急性肝損傷的基本機制之一。

MET作為臨床治療2型糖尿病的一線藥物,具有良好的安全性和性價比。MET主要通過抑制肝糖原新生、調(diào)節(jié)胰島素受體信號等方式調(diào)節(jié)血糖。臨床研究發(fā)現(xiàn)可以通過抑制炎癥反應等方式來減輕急性呼吸窘迫綜合征、腸道缺血再灌注損傷、腦脊髓炎等疾病的組織損傷[11-13]。本研究中,我們嘗試探討MET在APAP誘導肝損傷的潛在作用。實驗發(fā)現(xiàn)MET可顯著降低模型小鼠血漿中轉(zhuǎn)氨酶水平的異常升高并對肝組織病理學損傷有所改善,同時炎癥相關因子TNF-α和IL-6的表達也明顯受抑,以上結(jié)果證實MET在APAP肝損傷中具有抗損傷和抗炎作用。

JNK已被證實在多種組織器官(包括肝臟)的損傷、應激、細胞生存與凋亡等方面起著重要調(diào)節(jié)作用。Gunawan等[14]通過小鼠和體外細胞培養(yǎng)的研究發(fā)現(xiàn)在APAP導致的肝損傷中JNK被持續(xù)激活,并且發(fā)現(xiàn)JNK抑制劑SP600125在體外和體內(nèi)對APAP肝毒性有顯著的保護作用。Win等[15]研究發(fā)現(xiàn),沉默JNK在線粒體膜上結(jié)合位點Sab,可抑制JNK的持續(xù)激活和JNK在線粒體膜上定位,對APAP誘導的肝臟損傷起到保護作用。因此MET能否通過抑制JNK的激活對急性肝損傷發(fā)揮保護作用值得進一步探討。本研究中,與空白對照組比較,Western blot結(jié)果顯示APAP致肝損傷時JNK的磷酸化明顯增多。而MET干預后,p-JNK的表達含量又比APAP組明顯減少,提示MET預處理可減少APAP致肝損傷時JNK的磷酸化。

本研究證實了MET通過抑制JNK的磷酸化對APAP誘導急性肝損傷發(fā)揮保護作用。提示二甲雙胍具有治療急性肝損傷的潛在價值,并為其治療提供新的理論依據(jù)。但JNK信號調(diào)控網(wǎng)相當復雜,更全面的分子機制仍需進一步深入研究。