史紅陽(yáng),王 煜,張永紅,鄧文靜,李 維

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:shihy2003@126.com)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占所有肺癌的85%-90%,是與癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]。近幾十年來,NSCLC的診斷和治療策略有了很大的進(jìn)步,但NSCLC的預(yù)后仍然較差,5年總體生存率仍低于15%[2]。程序性死亡受體1(programmed death-1,PD1)是CD28家族成員之一,是一種參與維持外周耐受性的抑制受體,PD-1通過招募蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2,阻斷CD3/CD28誘導(dǎo)的PI3K活化和TCR下游的其他信號(hào)事件,最終抑制T細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和分化[3,4]。PD-1免疫檢查點(diǎn)是免疫系統(tǒng)重要的穩(wěn)態(tài)機(jī)制,有助于預(yù)防慢性感染患者的自身免疫和炎癥失控,然而,PD-1/PD-L1信號(hào)通路也被多種惡性腫瘤所控制,是腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)控的最重要機(jī)制之一[5]。厚樸是我國(guó)傳統(tǒng)中藥,基本上全身皆可入藥,在我國(guó)分布廣泛。厚樸中含揮發(fā)性油、生物堿及微量鹽酸等,其中和厚樸酚與厚樸酚作為其主要成分被廣泛研究,主要具有抗菌、抗病毒以及抗腫瘤的功能[6]。本研究探討厚樸酚通過PD-1/PD-L1信號(hào)通路介導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌增殖和凋亡的機(jī)制研究,為厚樸酚抗癌作用的臨床運(yùn)用提供前期工作基礎(chǔ)和理論支持。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株和組織樣本

人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和人支氣管上皮樣細(xì)胞HBE(陰性對(duì)照)購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。收集本院2017年8月至2018年5月經(jīng)臨床和病理確診的NSCLC組織標(biāo)本30例,收治患者在癌組織切除手術(shù)前無其他全身器質(zhì)性病變并未接受化療等治療,同時(shí)收集距離肺癌組織7 cm以上的肺黏膜組織為癌旁對(duì)照組,收集的癌組織和癌旁組織經(jīng)液氮處理后凍存在-80 ℃冰箱盡快用于后續(xù)試驗(yàn)。研究取得本院倫理委員會(huì)的論證許可(NO.2018-3-5-012),而且患者簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,PBS緩沖液和胰酶購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司,RNeasy Mini kit試劑盒、PrimeScriptTMRT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix EX Taq實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司,PD-1、PD-L1、18S rRNA引物由上海生工合成,Cell Lysis Buffer、PD-1 Rabbit mAb、PD-L1 Rabbit mAb購(gòu)自美國(guó)CST公司,CCK8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué),Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

把人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549凍存管和人支氣管上皮樣細(xì)胞HBE于37 ℃水浴鍋解凍,吸取細(xì)胞懸浮液移入事先準(zhǔn)備好的15 ml離心管中,加入5 ml含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基混勻,在200g下離心4 min,吸掉上清,加入1 ml培養(yǎng)基反復(fù)吹打均勻后轉(zhuǎn)移至加入10 ml預(yù)熱培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)過夜,棄上清液,用PBS洗滌細(xì)胞2次,每2 d換1次培養(yǎng)基,細(xì)胞匯合至80%以上后倒掉培養(yǎng)液,加入1 ml胰酶消化液(0.25%胰酶+0.02% EDTA)消化液,吸掉消化液,顯微鏡下發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮后加入5 ml預(yù)熱的培養(yǎng)基,用玻璃吸管吹打均勻,吸取一半細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶,加入8 ml培養(yǎng)基后于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與處理

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞接種于96孔板,調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104/孔,將細(xì)胞分為3組:對(duì)照組(0 μmol/L厚樸酚),低劑量(40 μmol/L)厚樸酚組,高劑量(80 μmol/L)厚樸酚組。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),人支氣管上皮樣細(xì)胞HBE為陰性對(duì)照組。

1.5 免疫組化

使用Max Vision法進(jìn)行免疫組化。將組織切片后,進(jìn)行常規(guī)脫蠟、水化以及抗原修復(fù)處理,于37 ℃中進(jìn)行一抗孵育2 h后,再孵育二抗30 min,使用DAB對(duì)組織進(jìn)行顯色5-10 min,再用蘇木素復(fù)染(2 min),使用PBS緩沖液作為陰性對(duì)照。

1.6 PD-L1和PD-1基因real-time RT-PCR分析

取-80 ℃冰箱組織標(biāo)本,加入液氮研磨,采用RNeasy Mini kit試劑盒從肺癌組織中提取總RNA,然后用PrimeScript RT Master mix進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,嚴(yán)格按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ說明書對(duì)生成的cDNA進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)PCR分析。PD-L1基因正反引物分別為5′-CATGACACA CCACCACCAGAGA-3′和5′-GGCATATAGAGGGCTCCACAA-3′,PD-1基因正反引物分別為5′-CCCCAAGGAAAAATCGAGGAG-3′和5′-GGGCGAGGGGCTGGGATATCT-3′,18S rRNA正反引物分別為5′-ACTACACACACCACCCA-3′和5′-ACACACACACACCCCCCA-3′。以18S rRNA為內(nèi)參,根據(jù)Ct值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.7 Western blot檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)豐度

取-80 ℃冰箱組織標(biāo)本,室溫解凍后PBS沖洗去除結(jié)締組織,加入Cell Lysis Buffer,勻漿研磨后收集細(xì)胞蛋白樣品,定量后取等量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜,采用5%脫脂奶粉封閉1 h后分別加入(1 ∶500)稀釋的PD-1 Rabbit mAb、PD-L1 Rabbit mAb,4 ℃孵育過夜。洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗,室溫孵育1 h后洗滌添加顯色液,拍照后進(jìn)行灰度值統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

取37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)的96孔板,每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/L)混勻繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng),小心吸棄孔內(nèi)上清夜,加入DMSO溶液150 μl/孔,震蕩混勻,使晶狀物充分溶解。選擇波長(zhǎng)570 nm,在30 min內(nèi)于全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度值(A),分別檢測(cè)0,24,48,72 h時(shí)細(xì)胞的吸光值。以所測(cè)A值為縱坐標(biāo),時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.9 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

采用Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞凋亡情況。取培養(yǎng)48 h后的3組細(xì)胞,離心洗滌后按照試劑盒說明書重懸細(xì)胞,加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC震蕩混勻,室溫避光條件孵育20 min,然后再加5 μl PI染液,孵育5 min,立即上機(jī)檢測(cè)。激發(fā)波長(zhǎng)Ex=488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)Em=530 nm,細(xì)胞凋亡率為早期凋亡(Q4)和晚期凋亡(Q2)細(xì)胞所占的比例數(shù)總和。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析方法

2 結(jié)果

2.1 PD-1、PD-L1 mRNA在肺癌組織中的表達(dá)

通過real-time RT-PCR法檢測(cè)了30例肺癌組織和癌旁組織中PD-1、PD-L1 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,肺癌組織中PD-1 mRNA、PD-L1 mRNA的表達(dá)均高于癌旁組織,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PD-1 mRNA:t=62.381,P=0.005;PD-L1 mRNA:t=47.971,P=0.008,見圖1)。

與癌旁組織比較,* * P <0.01圖1 PD-1、PD-L1 mRNA在肺癌組織的表達(dá)豐度Figure 1 Expression of PD-1 mRNA and PD-L1 mRNA in lung cancer tissues

2.2 PD-1、PD-L1蛋白在肺癌組織中的表達(dá)

Western blot檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)豐度,結(jié)果顯示,PD-1、PD-L1蛋白在肺癌組織的表達(dá)均高于癌旁組織,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PD-1蛋白:t=65.642,P=0.005;PD-L1蛋白:t=61.253,P=0.006,見圖2)。

2.3 厚樸酚下調(diào)肺癌細(xì)胞A549 PD-L1的表達(dá)

低劑量厚樸酚組和高劑量厚樸酚組蛋白的表達(dá)水平要低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(低劑量組vs對(duì)照組:t=93.215,P=0.003;高劑量組vs對(duì)照組:t=58.32,P=0.008);低劑量厚樸酚組和高劑量厚樸酚組間PD-L1的表達(dá),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖3)。

與癌旁組織比較,* * P <0.01圖2 肺癌組織中PD-1、PD-L1蛋白的表達(dá)Figure 2 Expression of PD-1 and PD-L1 proteins in lung cancer tissues

與對(duì)照組比較,* * P <0.01圖3 不同處理后PD-L1在肺癌細(xì)胞A549中的表達(dá)Figure 3 Comparison of the expression of PD-L1 protein in A549 cells among different groups

2.4 厚樸酚抑制肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞活力

與對(duì)照組相比,48 h和72 h時(shí)低劑量厚樸酚組和高劑量厚樸酚組肺癌細(xì)胞A549的吸光值顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表1)。

表1 不同劑量厚樸酚對(duì)肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞增殖的影響

2.5 厚樸酚誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示,對(duì)照組、低劑厚樸酚組及高劑量厚樸酚組肺癌細(xì)胞A549凋亡率分別為(1.21±0.15)%,(22.34±0.16)%和(19.13±0.12)%。與對(duì)照組比較,低劑量厚樸酚組和高劑量厚樸酚組的凋亡率升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(低劑量組vs對(duì)照組:t=77.182,P=0.005;高劑量組vs對(duì)照組:t=96.047,P=0.003,見圖4)。

圖4 厚樸酚對(duì)不同組肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞凋亡的影響Figure 4 Effect of magnolol on apoptosis of lung cancer cells A549

3 討論

厚樸酚是我國(guó)傳統(tǒng)中藥厚樸的主要活性成分之一,主要藥理作用就是抗腫瘤,其抗腫瘤機(jī)制主要包括誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞抗藥性等。越來越多的證據(jù)表明,PD-L1在許多類型的人類癌癥中得到表達(dá),包括非小細(xì)胞肺癌[7-10]。PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑對(duì)多種惡性腫瘤均有療效,被認(rèn)為是NSCLC的標(biāo)準(zhǔn)治療模式[11]。本文的研究結(jié)果提示厚樸酚具有抑制肺癌細(xì)胞A549增殖、促進(jìn)其凋亡的作用,其機(jī)制可能是厚樸酚下調(diào)PD-L1的表達(dá)參與調(diào)控PD-1/PD-L1信號(hào)通路。

通過免疫組化的方法揭示PD-L1蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞主要定位在癌細(xì)胞和癌間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜,而PD-1蛋白則主要定位在淋巴細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜[12],本研究采用RT-PCR以及Western blot檢測(cè)了PD-L1和PD-1在肺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)豐度,而在肺癌細(xì)胞A549中我們只檢測(cè)了PD-L1的表達(dá)水平,PD-L1和PD-1在肺癌組織的表達(dá)與上述通過免疫組化的方法得到的結(jié)果是一致的。研究報(bào)道PD-L1在急性髓系白血病[13]、多發(fā)性骨髓瘤[14]、淋巴瘤[15]、間變性大細(xì)胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤[16]中的表達(dá)是通過MEK-ERK或STAT3信號(hào)通路誘導(dǎo)的,在實(shí)體腫瘤中PD-L1的表達(dá)也被發(fā)現(xiàn)由于磷酸酶和緊張素同源物的功能障礙而激活PI3K-AKT通路而增加[17,18],本研究接下來將要論證PD-L1的上游調(diào)控通路以作為厚樸酚抗腫瘤機(jī)制的詳細(xì)分子基礎(chǔ)。王英澤等[19]發(fā)現(xiàn)一種由黃芪、金銀花、野菊花、鬼針草、半枝蓮以及甘草組成的中藥復(fù)方可以下調(diào)脾臟淋巴細(xì)胞PD-1的表達(dá),而對(duì)PD-L1的表達(dá)無明顯影響。本研究發(fā)現(xiàn)厚樸酚可以下調(diào)肺癌細(xì)胞A549 PD-L1的表達(dá),而厚樸酚對(duì)PD-1表達(dá)的影響未知,后續(xù)本研究將構(gòu)建小鼠肺癌模型以探討厚樸酚對(duì)PD-1表達(dá)的影響。PD-1或PD-L1的表達(dá)下調(diào)可以促進(jìn)體內(nèi)T細(xì)胞的活性從而促進(jìn)T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫,減少腫瘤細(xì)胞的逃逸反應(yīng)[20],我們采用低、高劑量的厚樸酚作用肺癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)厚樸酚下調(diào)PD-L1的表達(dá),同時(shí)也檢測(cè)了厚樸酚對(duì)肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)厚樸酚抑制肺癌細(xì)胞A549增殖并促進(jìn)凋亡,提示厚樸酚抗腫瘤的作用可能是通過下調(diào)PD-L1的表達(dá)參與PD-1/PD-L1通路來實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞凋亡是由caspase蛋白水解酶參與的一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果,厚樸酚可能通過下調(diào)PD-1/PD-L1發(fā)出凋亡誘導(dǎo)信號(hào)激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)論證。

綜上,厚樸酚可以下調(diào)肺癌細(xì)胞A549 PD-L1的表達(dá),通過調(diào)控PD-1/PD-L1信號(hào)通絡(luò)抑制肺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡,本研究為我國(guó)傳統(tǒng)中藥厚樸酚用于治療NSCLC提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論支持,但其調(diào)控PD-1/PD-L1表達(dá)的具體機(jī)制以及下游調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的具體機(jī)制仍需展開進(jìn)一步的研究。