熊文濤,沈雨民,陳明亮,羅世友,熊煥金,吳小燕,肖葉青

(江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所/水稻國家工程實(shí)驗(yàn)室(南昌)/國家水稻改良中心 南昌分中心,江西 南昌 330200)

東鄉(xiāng)野生稻(以下簡稱“東野”)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的分布緯度最北的普通野生稻,其蘊(yùn)藏了其他普通野生稻和栽培稻所不具備的強(qiáng)耐冷性[1-2]。近年來,研究人員陸續(xù)從東野后代群體中篩選到多個綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的耐冷株系[3-4]。其中,從東野和粳稻0298的雜交后代篩選的耐冷粳稻東野1號的稻蔸能成功越冬,該品種已通過江西省農(nóng)作物新品種審定[5]。目前,相關(guān)研究報道了東野的3個耐冷基因,以及低溫響應(yīng)調(diào)控因子ICE1的同源基因OrbHLH1[6]；通過QTL定位區(qū)段找到了候選基因LTT7[7]和Cold1[8],其中Cold1起源于中國普通野生稻,經(jīng)過人工馴化及篩選,現(xiàn)普遍存在于東北亞的粳稻品種中[8]。

贛香A是本課題組選用1504(贛早秈49號)、IR58025B、金23B、新露B和江農(nóng)早2號B等5個具不同優(yōu)良特性的保持系做親本,采用雜交、復(fù)交和系統(tǒng)選擇等方法選育出來的新品種[9]。該品種的綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良,如落色好、不早衰、千粒重較大、有香味等,而且對稻瘟病具有很強(qiáng)的抗性。

為了能夠?qū)|野中的耐冷基因?qū)脍M香B中,從而提高贛香B的耐冷性，我們在前期的研究中以贛香B為受體親本,以東野為供體親本,進(jìn)行回交,利用分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇,從回交后代中選擇性狀優(yōu)良的單株進(jìn)行耐冷性鑒定,創(chuàng)制了攜帶耐冷基因的贛香B品種[10]。之后對贛香B和耐冷性較好的株系IL742在常溫和低溫下的表型進(jìn)行測序及表達(dá)譜差異分析,找到了東野中與冷脅迫相關(guān)的6個基因[11]。為了進(jìn)一步探究這些冷脅迫相關(guān)基因的分子機(jī)理,本研究構(gòu)建了這些基因的過量表達(dá)載體,并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了轉(zhuǎn)基因陽性植株,可為進(jìn)一步研究這些基因的分子機(jī)理提供可靠的材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)化受體材料為贛香B的成熟種子;轉(zhuǎn)化菌株為農(nóng)桿菌EHA105;雙元轉(zhuǎn)化載體pCUbi3190由江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院超級稻中心提供。

1.2 超表達(dá)載體的構(gòu)建

以從越光材料中提取的cDNA為模板,用引物Os05g15770FKpnI(5′-GGGGTACCATGGCGTCCCGACGCCTTG-3′)和Os05g15770RSpeI(5′-GACTAGTTCACAGAACCTGATCCAGGAGACC-3′)以及KODFX酶(Takara)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了OsHI-XIPCDS序列。用KpnI和SpeI酶切PCR純化產(chǎn)物及pCUbi1390表達(dá)載體,然后通過DNA連接酶進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a體內(nèi),通過篩選克隆、酶切檢測以及測序分析獲得了正確的OsHI-XIP超表達(dá)載體。最后電激轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105,于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 愈傷組織的誘導(dǎo)及繼代

將贛香B的成熟種子去殼后用70%乙醇浸泡1 min,隨后用50%次氯酸鈉處理30 min,在轉(zhuǎn)速180 r/min的搖床上搖晃。用無菌水沖洗8～10次,最后將沖洗好的種子放到滅菌濾紙上晾干5 min。在每個倒有誘導(dǎo)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中放入12～13粒種子,放入(27±1)℃、黑暗環(huán)境下培養(yǎng)。經(jīng)過14 d的黑暗誘導(dǎo),挑選胚性愈傷組織,將其平均分成3等份，分別放入新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中在(27±1)℃、黑暗環(huán)境下繼代培養(yǎng)4 d。

1.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系建立

從固體劃線平板上挑取農(nóng)桿菌EHA105單克隆菌株,放入裝有5 mL YEB液體培養(yǎng)基的50 mL離心管中。將該離心管放置于200 r/min的搖床上，在28 ℃下暗培養(yǎng)20～24 h；之后將離心管中的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入加有100 mL YEB的500 mL三角瓶中,在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。當(dāng)OD600到達(dá)1.0時,將農(nóng)桿菌細(xì)胞在4 ℃條件下以8000 r/min離心15 min，進(jìn)行富集；最后用懸浮培養(yǎng)基將農(nóng)桿菌細(xì)胞重懸。將重懸后的農(nóng)桿菌細(xì)胞浸入水稻愈傷組織,在轉(zhuǎn)速50 r/min的搖床上緩和培養(yǎng)20～25 min,用滅菌濾紙吸干愈傷組織上的多余菌液。之后將這些愈傷組織轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基,在(27±1)℃、黑暗條件下共培養(yǎng)48 h。一旦在愈傷組織中出現(xiàn)了少量農(nóng)桿菌,即用加入了適當(dāng)濃度的頭孢噻肟無菌水清洗8～10次,再用滅菌濾紙吸干，然后將其轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基中,在(27±1)℃、黑暗條件下培養(yǎng)12 d。經(jīng)過第一輪篩選培養(yǎng)后,挑選正常的愈傷組織，將其轉(zhuǎn)移到新的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行第二輪培養(yǎng)。經(jīng)過10 d的第二輪篩選培養(yǎng),挑選新長出來的微小愈傷組織，再將其轉(zhuǎn)移到新的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行第三輪篩選,在(27±1)℃、黑暗下培養(yǎng)5 d。將第三輪篩選培養(yǎng)基中長出的顆粒狀的微小愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上,在(27±1)℃、黑暗條件下培養(yǎng)7 d;之后將愈傷轉(zhuǎn)移至新的分化培養(yǎng)基上,在(27±1)℃、光照條件下培養(yǎng)4 d。最后轉(zhuǎn)移分化出來的幼苗到生根培養(yǎng)基上,待幼苗長出較發(fā)達(dá)的茁壯根系時進(jìn)行移栽煉苗。

1.5 轉(zhuǎn)基因植株的檢測

剪取植株的幼嫩葉片,參考王關(guān)林等的CTAB法提取DNA,采用PCR方法擴(kuò)增檢測植株內(nèi)的潮霉素(HPT)基因。所用引物hpt557-F為5′-ACACTACATGGCGTGATTTCAT-3′,hpt557-R為5′-TCCACTATCGGCGAGTACTTCT-3′。反應(yīng)體系(10 μL): DNA模板30～50 ng、1.1×T3 Super PCR Mix 9.1 μL、10 μmol/L引物各0.2 μL。反應(yīng)條件:98 ℃ 2 min;98 ℃ 10 s,54 ℃ 10 s,72 ℃ 10 s,32個循環(huán)；72 ℃ 2 min,25 ℃ 1 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 超量表達(dá)載體OsHI-XIP+pCUbi1390的獲得

通過PCR擴(kuò)增、酶切等過程將該基因連接到pCUbi1390載體上(圖1),然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌,提取其質(zhì)粒進(jìn)行酶切或者PCR檢測及測序分析。共提取了15個質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測,結(jié)果只有3個質(zhì)粒能擴(kuò)增出目的條帶(894 bp)(圖2)。進(jìn)一步對這3個質(zhì)粒進(jìn)行測序比對發(fā)現(xiàn),OsHI-XIP+pCUbi1390-8質(zhì)粒序列正確(圖3)。

2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化

秈稻的遺傳轉(zhuǎn)化效率普遍較低,嚴(yán)重影響了秈稻品種轉(zhuǎn)基因工作的開展。為了提高秈稻的轉(zhuǎn)化效率,我們對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的贛香B轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了系統(tǒng)研究。統(tǒng)計結(jié)果表明:贛香B的侵染愈傷數(shù)為500,其中抗性愈傷數(shù)為82,轉(zhuǎn)化效率為16.4%;檢測轉(zhuǎn)基因苗數(shù)為23,其中陽性轉(zhuǎn)基因苗數(shù)為16,陽性苗率為69.6%；這兩個參數(shù)顯著高于其它大部分秈稻品種,可見,贛香B作為轉(zhuǎn)化受體,其轉(zhuǎn)化效果顯著優(yōu)于其他秈稻品種,是一個很好的秈稻轉(zhuǎn)基因受體材料。

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測及陽性苗的獲得

以獲得的23株ZH11轉(zhuǎn)化苗(編號為19OSH513_1～23)葉片的總DNA為模板,以hpt557-F/R為引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。然后分別取PCR產(chǎn)物5 μL,采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。結(jié)果(圖4)顯示,有16株ZH11轉(zhuǎn)化苗擴(kuò)增出潮霉素基因(HPT,557 bp),因此初步鑒定獲得了16株P(guān)CR陽性植株。最后,種植T0代的轉(zhuǎn)化苗，獲得了種子；目前已經(jīng)種植到T1代苗期(圖5)。

圖2 部分OsHI-XIP+pCUbi1390質(zhì)粒的PCR檢測結(jié)果

圖3 OsHI-XIP+pCUbi1390-8質(zhì)粒中基因片段的測序結(jié)果

3 討論與結(jié)論

贛香B是本課題組選育的優(yōu)質(zhì)秈型香稻保持系,其母本為贛香A,具有開花習(xí)性好、異交結(jié)實(shí)率高、抗稻瘟病、米質(zhì)優(yōu)良且有香味等特點(diǎn)。目前,利用贛香A已成功配制雜交稻品種或組合15個,并且通過了福建、海南、云南、四川、重慶、貴州、浙江和江西等多個省(市)品種審定,如贛優(yōu)明占、贛優(yōu)607、贛香優(yōu)702、贛優(yōu)810等。由于贛香B的綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良,是研究水稻重要農(nóng)藝性狀相關(guān)基因的重要材料,亟須建立該材料的遺傳轉(zhuǎn)化體系。目前,大部分秈稻品種的組織培養(yǎng)都面臨不同程度的困難,比如有些品種的愈傷組織不耐繼代,有些品種的抗性愈傷容易褐化死亡,有的品種的抗性愈傷不能分化成幼苗等,進(jìn)而導(dǎo)致秈稻品種的轉(zhuǎn)化效率極低。本試驗(yàn)首次成功建立了贛香B的遺傳轉(zhuǎn)化體系,而且轉(zhuǎn)化效率穩(wěn)定維持在16%以上,顯著高于一般秈稻品種的轉(zhuǎn)化效率。因此,贛香B可以作為優(yōu)良的秈稻轉(zhuǎn)化受體品種,從而建立起水稻高效率的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

B代表空白對照；N代表陰性對照；P代表陽性對照。圖4 轉(zhuǎn)化再生植株P(guān)CR檢測結(jié)果

圖5 T1代的田間轉(zhuǎn)化苗

東野是迄今為止分布緯度最高的普通野生稻,除了蘊(yùn)藏著豐富的種質(zhì)資源、具有強(qiáng)抗逆性外,還擁有其他普通野生稻和栽培稻所沒有的強(qiáng)耐冷性,具有很大的育種價值。為了讓贛香B能夠獲得較強(qiáng)的耐冷性,本研究前期已構(gòu)建以贛香B為受體親本,以東野為供體親本的滲入系群體,并通過冷脅迫處理篩選出了贛香B的耐冷株系?；谀屠渲晗岛挖M香B的轉(zhuǎn)錄組比較分析,篩選出6個響應(yīng)冷脅迫的基因,我們重點(diǎn)研究了其中的OsHI-XIP基因。該基因亞細(xì)胞定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,編碼1個糖基水解酶；過量表達(dá)OsHI-XIP基因能夠增強(qiáng)水稻對植食性昆蟲的抗性[12]。目前尚未見該基因耐冷方面的報道。為了進(jìn)一步研究OsHI-XIP的生物學(xué)功能,我們構(gòu)建了OsHI-XIP的超表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將OsHI-XIP基因轉(zhuǎn)入贛香B的愈傷組織中,通過篩選、分化培養(yǎng)獲得了轉(zhuǎn)基因苗(圖5)。這為后期進(jìn)一步研究耐冷基因的生物學(xué)功能,為研究東野的耐冷機(jī)制提供了可能。本研究首次建立了以贛香B為受體的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的秈稻高效遺傳轉(zhuǎn)化體系,為后期研究優(yōu)良農(nóng)藝性狀相關(guān)基因的分離、克隆及生物學(xué)功能驗(yàn)證奠定了堅實(shí)的材料基礎(chǔ)，提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐,也為水稻分子育種奠定了基礎(chǔ)。