胡紫微,李至敏,張夢潔,徐依婷,李志敏**

(1. 江西農(nóng)業(yè)大學 生物科學與工程學院,江西 南昌330045;2. 江西農(nóng)業(yè)大學 理學院,江西 南昌330045)

指狀青霉(Penicilliumdigitatum)導致柑橘果實采后腐爛形成的綠霉病是柑橘類果實在儲存運輸期間發(fā)生的最嚴重病害之一[1]。目前一般多用化學殺菌劑抑制指狀青霉的生長來防治綠霉病,比如咪鮮胺(撲霉靈)、抑霉唑、噻苯唑、鄰苯基苯酚鈉等物質[2,3]。然而化學殺菌劑在柑橘果實的殘留對人體的潛在風險,病原菌對化學殺菌劑的耐藥性以及化學殺菌劑引發(fā)的食品安全、環(huán)境污染等問題,使得人們開始采用生物防治方法來控制柑橘果實采后病害[4]。生物防治策略主要包括微生物保鮮劑、植物源提取物、天然化合物、食品添加劑、公認安全的化合物等方面及其聯(lián)合使用的策略[5]。然而這些策略方法并沒有取得較好的防治綠霉病效果。

隨著2012年指狀青霉全基因組序列的公布[6],從分子水平解釋指狀青霉致病機理的研究越來越多。多個研究表明,在指狀青霉致病過程中,果膠裂合酶基因(Pnl1)[7]、pH信號轉錄因子基因(PdpacC)[8]、分裂素激活蛋白激酶基因(PdMpkB)[9]等都發(fā)揮了關鍵作用。此外,人們發(fā)現(xiàn)真菌的致病性與其生長過程中草酸的分泌相關[10-11]。包括食品生物技術真菌黑曲霉(Aspergillusniger)、植物病原真菌灰霉菌(Botrytiscinerea)與核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)、人類條件致病菌煙曲霉(Aspergillusfumigatus)和許多褐腐擔子菌、白腐擔子菌在內的絲狀真菌可以產(chǎn)生大量草酸[12]。毒力機制研究認為酸化觸發(fā)了木質纖維素的降解,降低了寄主組織的活力,有利于病原體的增殖,同時草酸的合成可以誘導草酸鈣結晶的形成,從而阻塞血管或導管[10,13]。真菌產(chǎn)生草酸主要有3種潛在途徑:乙醛酸的氧化、羥基乙醛的氧化和草酰乙酸的水解[14]。

草酰乙酸水解酶(Oxaloacetate hydrolase,OAH,EC 3.7.1.1)催化草酰乙酸水解形成乙酸和草酸,是草酰乙酸水解生成草酸的關鍵酶(圖1)[15-16]。體內研究發(fā)現(xiàn)將編碼OAH的基因敲除失活后,灰霉菌合成草酸的能力基本喪失[14]。轉錄組研究發(fā)現(xiàn)指狀青霉在侵染柑橘果實的過程中Oah基因轉錄水平大幅提高[7],由此可見指狀青霉草酰乙酸水解酶(PdOAH)可能是該菌侵染柑橘果實的關鍵因子。由于PdOAH是指狀青霉中一個可能的致病因子,針對PdOAH的抑制劑研究將會為指狀青霉的防治提供新思路。PdOAH的結構特征信息有助于抑制劑的理性設計,原核表達純化的重組蛋白將為PdOAH的生化特征和催化機理研究提供重要的基礎材料。

本實驗首先對PdOAH的生物信息學進行了詳細研究,探索了其催化中心的關鍵氨基酸殘基。然后人工合成了編碼PdOAH的基因并將其構建到pET-21a載體,在大腸桿菌表達系統(tǒng)中進行了重組PdOAH的誘導表達和分離純化,研究了溫度和異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)濃度對其誘導表達的影響。

圖1 OAH催化草酰乙酸水解形成草酸和乙酸

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞由本實驗室保藏。pET21a-OAH重組質粒由上海祥音生物科技有限公司合成。PageRuler預染蛋白Ladder購自ThermoFisher Scientific公司。0.22 μm過濾器購于Millipore公司。鎳-次氮基三乙酸(Ni-NTA)瓊脂糖凝膠樹脂購于QIAGEN公司。胰蛋白胨、酵母提取物購于OXOID公司。質粒測序由上海祥音生物科技有限公司完成。其它主要試劑均為分析純,購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 指狀青霉草酰乙酸水解酶(PdOAH)的生物信息學分析

利用ExPAsy-ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)進行等電點、蛋白分子量、穩(wěn)定性等預測。在NCBI中找到指狀青霉來源的草酰乙酸水解酶基因序列,同時進行BLAST序列分析。利用在線軟件ESPript 3.0 (http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)分析蛋白氨基酸結構。利用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/interactive)進行蛋白結構預測。利用 PyMOL軟件對蛋白的三維空間結構進行模擬展示。

1.3 溫度對重組PdOAH表達的影響

挑取pET21a-OAHBL21(DE3)單克隆菌落，將其接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL的Amp)中,于37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。次日,按1%接種量轉接于100 mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL的Amp)中,于37 ℃、180 r/min下培養(yǎng)一定時間。當OD600 nm值為0.6左右時,于冰水浴中冷卻30 min,加入誘導劑IPTG(終濃度為0.2 mmol/L),分別置于16、25、30、37 ℃,180 r/min條件下誘導表達24 h。在第3天,將菌液以4000 r/min離心15 min，然后收集菌體。用體積質量比為20∶1的20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)緩沖液重懸菌體,并進行超聲破碎(超聲條件:變幅桿10 mm,工作時間2 s,間隔時間8 s,功率10%,工作總時間2 min)；將細胞破碎液于4 ℃、12000 r/min離心30 min，得到上清和沉淀；加入4×蛋白上樣緩沖液，混合均勻后在100 ℃下加熱處理5 min；最后用12.5% (v/v)的SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達情況。加樣體積均為10 μL。

1.4 IPTG濃度對PdOAH表達的影響

挑取pET21a-OAHBL21(DE3)單克隆菌落，將其接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL的Amp)中,于37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。次日,按1%接種量轉接于100 mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL的Amp)中,于37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)一定時間。當OD600 nm值約為0.6時,于冰水浴中冷卻30 min,然后分別加入不同濃度(0、0.01、0.05、0.20和1.00 mmol/L)的IPTG,并置于16 ℃、180 r/min條件下誘導表達24 h。在第3天,將菌液以4000 r/min離心15 min，收集菌體。用20倍體積的20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)緩沖液重懸菌體,并進行超聲破碎(超聲條件:變幅桿10 mm,工作時間2 s,間隔時間8 s,功率10%,工作總時間2 min)；將細胞破碎液于4 ℃下以12000 r/min離心30 min，得到上清和沉淀；加入4×蛋白上樣緩沖液，混合均勻后于100 ℃加熱處理5 min；最后用12.5% (v/v)的SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達情況。加樣體積均為10 μL。

1.5 重組PdOAH的誘導表達

挑取pET21a-OAHBL21(DE3)單克隆菌落，將其接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL的Amp)中,于37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。次日,按1%接種量轉接于400 mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL的Amp)中擴大培養(yǎng)。當OD600 nm值為0.6左右時,于冰水浴中冷卻30 min；然后加入IPTG(終濃度為0.2 mmol/L),置于16 ℃、180 r/min條件下誘導表達24 h。第3天,將菌液以4000 r/min的轉速離心15 min，收集菌體，以備后續(xù)分離純化使用。

1.6 重組PdOAH的分離純化

將誘導表達得到的pET21a-OAHBL21(DE3)菌體用20倍體積(g/mL)的binding buffer(20 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0緩沖液)重懸,用超聲波細胞粉碎機將菌液進行超聲破碎,將細胞破碎液置于4 ℃、12000 r/min冷凍高速離心機中離心1 h，將獲得的上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，然后上樣于10 mL Ni-NTA樹脂[事先用20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)緩沖液平衡];隨后用20～200 mmol/L咪唑洗脫緩沖液(含20～200 mmol/L咪唑、300 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0)進行濃度梯度洗脫,分別收集不同咪唑濃度下的蛋白洗脫液。加入4×蛋白上樣緩沖液，混合均勻后在100 ℃下處理5 min，獲得樣品,最后用12.5% (v/v)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測蛋白掛柱情況,分析雜蛋白和目的蛋白的分離情況,確定最佳的洗脫咪唑濃度。

2 結果與分析

2.1 PdOAH的生物信息學分析

生物信息學分析發(fā)現(xiàn)PdOAH基因的核苷酸大小為1005 bp,可編碼334個氨基酸。PdOAH蛋白的理論分子量大小是36.53521 kDa,等電點(pI)為6.01,親水性和不穩(wěn)定性指數(shù)分別為-0.074和26.06,表明PdOAH為親水性蛋白且是穩(wěn)定的。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn),PdOAH屬于異檸檬酸裂解酶/磷酸烯醇丙酮酸變位酶超家族成員(ICL/PEPM superfamily),具有Mg2+/Mn2+結合位點(圖2)。PdOAH與來源于其它3種真菌的OAH氨基酸序列比對結果如圖3所示。氨基酸序列比對結果表明PdOAH與黑曲霉、灰霉菌及板栗疫病菌(Cryphonectriaparasitica)來源的OAH氨基酸序列同源性分別為83.59%、73.66%及72.66%。PdOAH蛋白的二級結構預測如圖4B所示。該蛋白含有11個α-螺旋、6個β-折疊以及多個無規(guī)則卷曲，其中α-螺旋占比高達44.6%,含有149個氨基酸;β-折疊占比較低，為11.07%,含有37個氨基酸。

圖2 PdOAH氨基酸序列的結構分析結果

2.2 PdOAH的建模結構分析

Chen等[17]于2010年解析出板栗疫病菌OAH的晶體結構(PDB ID:3m0k)。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)PdOAH與板栗疫病菌OAH的氨基酸序列同源性高達72.66%(圖3),因此選擇板栗疫病菌OAH蛋白作為模板(PDB ID:3m0k),應用SWISS-MODEL在線工具對PdOAH進行同源建模,建模結果如圖4所示。PdOAH蛋白的整體結構類似于ICL/PEPM超家族的其它成員[18],均由二聚體結合二聚體形成了同源四聚體(圖4A)。PdOAH蛋白與ICL/PEPM超家族其它成員一樣,催化活性中心位于結構的中心。催化中心的氨基酸殘基大部分都位于α-螺旋和β-折疊的末端,這與前期預測的二級結構結果是一致的。PdOAH蛋白催化中心的結構示意圖如圖5所示。在催化中心中可能與產(chǎn)物草酸有氫鍵作用的氨基酸殘基有Tyr69、Ala73、Thr71、Gly72、Asp113、Arg187、Asn240和Ser266(圖5)。

QBN20786.1、BAM16481.1、AAS99938.1和ADF28676.1分別代表來源于指狀青霉、黑曲霉、灰霉病、板栗疫病菌的OAH。三角形所示為參與酶催化的氨基酸殘基。

A:PdOAH蛋白四聚體結構;B:PdOAH蛋白單體結構。關鍵氨基酸殘基(綠色為碳原子，深藍色為氮原子)和產(chǎn)物草酸(碳原子為淡藍色，氧原子為紅色)為棍棒結構,金屬離子(Mn2+)為紫色球形。α-螺旋、β-折疊及無規(guī)則卷曲分別為紅色、黃色和綠色。黑色虛線為催化中心的氫鍵。

2.3 溫度對重組PdOAH原核表達的影響

固定誘導劑IPTG的終濃度為0.2 mmol/L,將pET21a-OAHBL21(DE3)表達菌株分別置于16、25、30、37 ℃,180 r/min條件下誘導表達24 h后,重組PdOAH蛋白的誘導表達情況如圖6所示。泳道1、4、7、10分別對應上述4個溫度誘導表達后的細胞破碎液(圖6),由此可知PdOAH蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中表達量很高,但隨著溫度的升高表達量逐漸減少，由此表明pET21a-OAHBL21(DE3)菌株在上述4個溫度下都能大量表達目的蛋白,而在16 ℃下誘導表達的目的蛋白含量最高。泳道2、5、8、11對應上述溫度下表達細胞破碎離心后的上清液,在16 ℃條件下上清液中PdOAH含量最多(圖6)。由此可見溫度對重組PdOAH蛋白的誘導表達具有明顯的影響。因此,后續(xù)將用16 ℃、180 r/min條件對pET21a-OAHBL21(DE3)菌株進行誘導表達。

OXL指草酸(碳原子為淡藍色)；關鍵氨基酸殘基(碳原子為綠色)旁的數(shù)字為其在PdOAH蛋白質氨基酸序列中的位置。黑色虛線為催化中心的氫鍵。

M:蛋白質標準;泳道1～3號分別為16 ℃誘導表達的全菌、上清、沉淀;泳道4～6號分別為25 ℃誘導表達的全菌、上清、沉淀;泳道7～9號分別為30 ℃誘導表達的全菌、上清、沉淀;泳道10～12號分別為37 ℃誘導表達的全菌、上清、沉淀。

2.4 誘導劑IPTG濃度對重組PdOAH原核表達的影響

固定溫度為16 ℃,將pET21a-OAHBL21(DE3)表達菌株分別加入終濃度為0、0.01、0.05、0.20和1.00 mmol/L的IPTG后誘導表達24 h,重組PdOAH蛋白的誘導表達情況如圖7所示。泳道1、3、5、7、9分別對應上述5個IPTG濃度誘導表達后的細胞破碎液,由圖7可知PdOAH蛋白在未加入IPTG誘導劑時基本不表達,0.01、0.05、0.20、1.00 mmol/L的IPTG對PdOAH蛋白的誘導表達量相當。泳道2、4、6、8、10對應上述5個IPTG濃度下表達細胞破碎離心后的上清液,結果表明IPTG濃度對其可溶性表達幾乎沒有影響(圖7)。因此,后續(xù)將用0.20 mmol/L IPTG對pET21a-OAHBL21(DE3)菌株進行誘導表達。

M:蛋白質標準;泳道1～2號分別為0 mmol/L IPTG誘導的全菌和上清;泳道3～4號分別為0.01 mmol/L IPTG誘導的全菌和上清;泳道5～6號分別為0.05 mmol/L IPTG誘導的全菌和上清;泳道7～8號分別為0.20 mmol/L IPTG誘導的全菌和上清;泳道9～10號分別為1.00 mmol/L IPTG誘導的全菌和上清。

2.5 重組PdOAH蛋白的分離純化

利用Ni-NTA瓊脂糖凝膠親和層析技術分離純化重組PdOAH蛋白。與表達的其它雜蛋白相比,目的PdOAH蛋白含有多聚組氨酸(6×His)標簽，從而與Ni2+結合更緊密,因此雜蛋白和目的蛋白在不同濃度的咪唑洗脫液中可以分別被洗脫出來(圖8)。流穿液(FT)中含有大量的雜蛋白,表明雜蛋白因不含6×His標簽而不與Ni2+結合。然而,泳道FT同樣顯示約50%的目的PdOAH蛋白未與Ni2+緊密結合?？赡艿脑蚴侵亟MPdOAH蛋白由于部分溶解、折疊不正確或與其它分子結合而引起表面結構的變化[19],導致6×His標簽未完全暴露,造成PdOAH蛋白與Ni2+的親和力降低,使得部分PdOAH蛋白未能掛柱。在200 mmol/L咪唑濃度下成功洗脫出大量目的PdOAH蛋白。收集純度較高(圖8中泳道7～11)的蛋白進行濃縮脫鹽處理,以備后續(xù)酶活力測定使用。

M:蛋白質標準;WC:全菌;S:上清液;FT:流穿液;1～4號分別為20、40、60、80 mmol/L咪唑洗脫液;5～11號均為200 mmol/L咪唑洗脫液。

3 討論與結論

病原菌利用體內生物合成的草酸侵染和破壞植物組織,因此草酸的生物合成可能是病原菌致病的關鍵因素。真菌生物合成草酸的一個重要途徑是OAH催化草酰乙酸水解。在對核盤菌草酸生物合成途徑的研究中,人們發(fā)現(xiàn)當OAH基因缺失時,核盤菌體內和菌核中草酸的積累會消除,而將OAH基因重新導入缺失株后,草酸的積累又恢復到野生型的水平[20]。在對黑曲霉[14]、板栗疫病菌[18]、產(chǎn)黃青霉菌[21]的研究中,也存在類似的現(xiàn)象,從而進一步證明真菌中草酰乙酸的水解是形成草酸的一條重要途徑,對草酸的生物合成具有重要貢獻。因此,為了研究指狀青霉中草酸的合成途徑,后續(xù)需要對OAH基因進行敲除,從而確定指狀青霉中草酸生成的基本途徑,這對柑橘果實綠霉病的防治有重大意義。

生物信息學分析發(fā)現(xiàn)PdOAH蛋白屬于異檸檬酸裂解酶/磷酸烯醇丙酮酸變位酶超家族。該家族蛋白催化含有C-C鍵或者P-C鍵底物的裂解,因而該家族又分為“C-C鍵裂解酶”和“P-C鍵裂解/形成酶”兩大分支[17]。C-C鍵裂解酶分支主要成員有異檸檬酸裂合酶、2-甲基異檸檬酸裂合酶、草酰乙酸水解酶和花瓣死亡蛋白酶等,催化各種羥基酸底物C-C鍵的裂解,形成α-羥基羧酸[22-24]。P-C鍵裂解酶分支成員包括磷酸烯醇丙酮酸突變酶、磷酸基丙酮酸水解酶和羧基PEP突變酶等,催化α-酮羧酸底物中的磷酸鍵裂解形成烯酸中間體[25-27]。PdOAH蛋白屬于C-C鍵裂解酶分支。氨基酸序列比對結果顯示PdOAH蛋白與其它來源的OAH蛋白具有高度的同源性,并且催化活性中心的大部分氨基酸殘基高度保守,這為后續(xù)研究PdOAH的催化機理奠定了基礎。生物信息學預測的PdOAH蛋白的二級結構與同源建模獲得的二級結構具有較高的一致性,說明該預測結構和建模結構質量較高。

本研究探索了不同溫度和IPTG濃度對重組PdOAH原核表達量及可溶性的影響,確定了誘導表達的最適溫度和最適IPTG濃度。在16 ℃條件下,重組PdOAH蛋白的表達量最高;當IPTG濃度大于0.2 mmol/L時,重組PdOAH蛋白可溶性最佳。Ni-NTA親和層析純化結果表明,在200 mmol/L咪唑洗脫液下可以獲得純度較高的重組PdOAH蛋白。本研究結果為今后進一步探索PdOAH蛋白的酶動力學參數(shù)和催化機理，以及開發(fā)草酰乙酸水解酶抑制劑奠定了基礎，也將為柑橘果實綠霉病的防治提供科學依據(jù)。