劉 嘉，苗小猛，徐景峨*，陶宇航，蒲 齡，楊 莉，張亞楠，李 婷，余 波，趙 濱，楊粵黔

(1.貴州省畜禽遺傳資源管理站，貴州 貴陽 550001；2.貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005)

鴨疫里默氏桿菌(Riemerellaanatipestifer，RA)可引起鴨、鵝等禽類感染慢性或急性敗血性漿膜炎，對我國養(yǎng)鴨業(yè)造成極大的威脅及沖擊[1]。其主要的免疫原性外膜蛋白為外膜蛋白A(Outer membrance protein A, OmpA)，廣泛存在于目前已經(jīng)測序的所有鴨疫里默氏桿菌菌株中，故常被作為鴨疫里默氏桿菌的鑒定因子[2]。熒光定量PCR技術(shù)相對于普通PCR技術(shù)而言更為靈敏、便捷、直觀，可針對微生物DNA、RNA目的片段進行快速定量檢測[3]。故可根據(jù)OmpA基因保守序列設(shè)計熒光定量PCR引物以準確、迅速鑒定鴨疫里默氏桿菌。然而，在實際檢測和科研過程中，由于樣本量大小或者儀器檢測量的原因，往往存在DNA樣品保存?zhèn)溆没蛘邔ν籇NA樣品反復(fù)檢測的需求[4]，因此研究不同保存溫度和反復(fù)凍融次數(shù)對鴨疫里默氏桿菌檢測效果的影響具有一定的現(xiàn)實意義。本研究建立了鴨疫里默氏桿菌熒光定量PCR鑒定方法，并探究了保存于室溫、4 ℃、-20 ℃、-80 ℃條件下及-20 ℃、-80 ℃下反復(fù)凍融的不同濃度梯度組鴨疫里默氏桿菌DNA樣品濃度及熒光定量Ct值的變化，以期為鴨疫里默氏桿菌的實際檢測和科學(xué)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

由貴州省畜牧獸醫(yī)研究所畜禽疫病研究室分離、鑒定并保存的鴨疫里默氏桿菌(血清I型)及大腸桿菌(編號ATCC25922)、沙門菌(編號ATCC13076)、多殺性巴氏桿菌(A型)。

1.2 主要試劑及儀器

胰酶大豆肉湯培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基購于環(huán)凱微生物科技(廣東)有限公司；四季青新生牛血清購于天杭生物科技(浙江)有限公司；瓊脂糖、DNA Marker DL2000、SYBR Green RT-PCR試劑盒購于寶生物(大連)有限公司；DNase/RNase-free H2O、2×Es Taq Masterm Mix購于康為世紀生物科技(北京)有限公司、Gold view核酸染液購于索萊寶科技(北京)有限公司。

儀器主要有：普通PCR儀(T 100，Bio-Rad)、實時熒光定量PCR儀(Mastercyler ep realplex，Eppendorf)、超微量分光光度計(N 50，IMPLEN)、水平電泳儀(DYCP-31E，北京六一生物科技有限公司)、凝膠成像系統(tǒng)(Gel DocTMEQ170-8060，Bio-Rad)等。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 DNA的提取 將鴨疫里默氏桿菌、多殺性巴氏桿菌菌株接種到5 mL胰酶大豆肉湯液體培養(yǎng)基(加5%的初生牛血清)，將大腸桿菌、沙門菌菌株接種到5 mL的LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床15 h后，12000 r/min離心10 min，棄上清并收集菌體。加入ddH2O重懸洗滌菌體，洗滌完成后，采用水煮法[5]提取總DNA。

1.3.2 DNA濃度的檢測 使用IMPLEN超微量分光光度計記錄DNA濃度、OD260/OD280。

1.3.3 DNA的梯度稀釋 提取DNA后，原液A用ddH2O依次進行101、102、103倍梯度稀釋，分別記為B、C、D組。

1.3.4 保存溫度 DNA樣品梯度稀釋后，A、B、C、D每組各60個樣品，每個樣品15 μL。分別保存于室溫、4 ℃、-20 ℃、-80 ℃，每組樣品各15個，每組每個保存溫度設(shè)3個重復(fù)。于0、7、14、21、28 d進行濃度測定及熒光定量分析。

1.3.5 反復(fù)凍融 DNA樣品A、B、C、D組，每組30個樣品，每個樣品15 μL。分別保存于-20 ℃、-80 ℃，每組各15個樣品，共3個重復(fù)。反復(fù)置于室溫凍融，凍融次數(shù)分別為0、7、14、21、28次，使用核酸蛋白儀檢測反復(fù)凍融后DNA的濃度，使用熒光定量PCR檢測Ct值。

1.3.6 引物設(shè)計 使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計OmpA(GenBank: KY399243.1)引物，上游引物為5′-AATAGGTGTTGGTGCTCAT-3′，下游引物為5′-CAAACTCTTGCCTGTAAAT-3′，產(chǎn)物大小為112 bp，退火溫度為56 ℃。由生工生物工程股份有限公司合成。

1.3.7 引物特異性檢測 將4種菌的DNA分別按照95 ℃，5 min；(94 ℃，30 s；56 ℃，30 s；72 ℃，1 min)×30；72 ℃，5 min的程序進行普通PCR擴增，反應(yīng)體系為2×Es Taq Masterm Mix 12.5 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、DNA樣品2 μL、ddH2O 8.5 μL。擴增產(chǎn)物于1.5%凝膠電泳，判定是否出現(xiàn)特異性單一條帶。

1.3.8 瓊脂糖凝膠電泳 稱取15 g瓊脂糖加熱溶解于100 mL超純水中，并加入10 μL的Gold view核酸染液，制成1.5 %瓊脂凝膠。將PCR產(chǎn)物及DNA Marker DL 2000各5 μL點入膠孔中，在220 V電壓下水平電泳10 min，結(jié)束后將膠塊置于凝膠成像系統(tǒng)中照相、保存。

1.3.9 熒光PCR檢測 反應(yīng)體系為SYBR?Prime Ex TaqTM Ⅱ 12.5 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、DNA樣品2 μL、ddH2O 8.5 μL。擴增程序為95 ℃，5 min；(94 ℃，30 s；56 ℃，30 s；72 ℃，1 min)×30；72 ℃，5 min。使用Eppendorf 實時熒光定量PCR儀進行擴增，收集Ct值。同時，將大腸桿菌、沙門菌、多殺性巴氏桿菌、鴨疫里默氏桿菌的DNA分別進行熒光定量PCR，判定是否為特異性擴增曲線。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析 DNA濃度、Ct值等原始數(shù)據(jù)用 Excel 2010 整理，使用SPSS 19.0的One-way Anova程序進行方差分析，以Tukey法進行多重比較，顯著水平為P<0.05，結(jié)果用“均值±標準誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性檢測

由圖1可知，凝膠電泳后，僅有第1泳道的鴨疫里默氏桿菌出現(xiàn)單一的112 bp目的條帶，而大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、沙門菌、ddH2O均未出現(xiàn)產(chǎn)物條帶。經(jīng)過熒光定量PCR檢驗后，發(fā)現(xiàn)僅有鴨疫里默氏桿菌出現(xiàn)特異性擴增曲線，其余樣本均未出現(xiàn)(圖2)。表明引物特異性良好，可以用于鴨疫里默氏桿菌熒光定量PCR檢測。

1：鴨疫里默氏桿菌；2：大腸桿菌；3：多殺性巴氏桿菌；4：沙門菌；5：ddH2O；M：DNA分子質(zhì)量標準。

1：鴨疫里默氏桿菌；2：大腸桿菌；3：多殺性巴氏桿菌；4：沙門菌；5：ddH2O。圖2 DNA熒光定量PCR檢測曲線

2.2 鴨疫里默氏桿菌DNA的稀釋

用水煮法提取鴨疫里默氏桿菌的DNA，經(jīng)檢測，所提DNA的OD260/OD280均在1.8～2.2，DNA純度較好。測定濃度后用ddH2O依次進行101、102、103倍梯度稀釋，稀釋后濃度見表1。將原液DNA和稀釋DNA進行熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)隨著濃度的下降，Ct值逐漸升高(圖3)。

表1 DNA原始濃度和稀釋濃度 ng/μL

2.3 保存溫度對鴨疫里默氏桿菌DNA的影響

將A、B、C、D等4個不同濃度的鴨疫里默氏桿菌DNA保存于室溫、4 ℃、-20 ℃、-80 ℃，于0、7、14、21、28 d進行濃度測定及熒光定量。由表2可知：在0 d時，溫度對DNA濃度無顯著性影響(P>0.05)；在7 d時，保存于-20 ℃、-80 ℃的DNA濃度顯著高于室溫和4 ℃(P<0.05)；在14 d時，保存于常溫的DNA樣品濃度與其他溫度組相比顯著降低50%(P<0.05)，B組保存于4 ℃的DNA樣品濃度顯著低于-20 ℃和-80 ℃保存的樣品；在21 d時，A、B組常溫下DNA樣品濃度比其他溫度組顯著降低89%，且在-20 ℃保存時濃度最高(P<0.05)，而C、D組保存于4 ℃、-20 ℃、-80 ℃下的DNA濃度間均無顯著性差異(P>0.05)；在28 d時，保存于常溫的DNA樣品出現(xiàn)更明顯的降解，濃度降至10 ng/μL以下，A、B組濃度表現(xiàn)為-80 ℃>-20 ℃>4 ℃>常溫(P<0.05)，而C、D組保存于4 ℃、-20 ℃、-80 ℃下的DNA濃度間均無顯著性差異(P>0.05)。

1：原始濃度A；2：101倍稀釋濃度B；3：102倍稀釋濃度C；4：103倍稀釋濃度D。圖3 梯度稀釋后熒光PCR檢測曲線

表2 不同保存溫度下鴨疫里默氏桿菌DNA濃度的變化 ng/μL

熒光定量檢測結(jié)果見表3。0 d時各組樣品Ct值無明顯的組間差異(P>0.05)；7～28 d時，常溫保存的DNA樣品Ct值整體高于其他溫度(P<0.05)；7 d時，A、B、C組保存于-80 ℃時的Ct值最低(P<0.05)，而14 d時D組DNA樣品Ct值并沒有表現(xiàn)出溫度導(dǎo)致的組間差異(P>0.05)。

2.4 凍融次數(shù)對鴨疫里默氏桿菌DNA的影響

由表4可知，相同濃度組經(jīng)歷不同的凍融次數(shù)后，于-20 ℃、-80 ℃保存的DNA濃度均隨著凍融次數(shù)的增加而顯著下降(P<0.05)。其中，對于高濃度A組而言，凍融7次之后，DNA濃度分別下降了42.48%、47.22%，但14～28次凍融較7次并未出現(xiàn)較大幅度的降解。中高濃度B組在-20 ℃、-80 ℃下保存時，經(jīng)7次凍融，濃度分別下降了34.72%、43.05%，經(jīng)14～28次凍融后出現(xiàn)較小幅度的濃度降低(P<0.05)。-20 ℃保存的C組經(jīng)0、7、14次凍融后濃度無明顯變化(P>0.05)，經(jīng)21次凍融后出現(xiàn)顯著下降趨勢(P<0.05)；在-80 ℃下，DNA經(jīng)28次凍融后濃度出現(xiàn)大幅度的下降(P<0.05)，較0次下降了78.29%，較14次下降了65.19%，較21次下降了50.00%。而保存于-20 ℃的低濃度D組經(jīng)7次凍融后，濃度下降了34.80%，經(jīng)28次凍融則下降了82.80%；保存于-80 ℃時，第7次凍融后濃度較0次下降了83.87%，經(jīng)28次凍融后則濃度下降了91.13%，在7、14、21、28次凍融處理間濃度無顯著差異(P>0.05)。

表3 不同保存溫度下鴨疫里默氏桿菌DNA樣品Ct值變化

表4 鴨疫里默氏桿菌DNA樣品經(jīng)反復(fù)凍融后的濃度變化 ng/μL

熒光定量PCR檢測結(jié)果見表5。結(jié)果表明，-20 ℃、-80 ℃保存的A組、B組DNA樣品的Ct值均未受凍融次數(shù)的影響(P>0.05)，A組的Ct值均為12左右，B組的Ct值為15左右。C組、D組DNA樣品的Ct值則隨凍融次數(shù)的增加而上升(P<0.05)，其中在-20 ℃下，C組7次與14次凍融樣品的Ct值之間，以及21次與28次凍融樣品的Ct值之間，均無顯著差異(P>0.05)；D組0次、14次、21次凍融樣品的Ct值之間，7次、14次、21次凍融樣品的Ct值之間，21次、28次凍融樣品的Ct值之間，均無顯著性差異(P>0.05)。在-80 ℃下，C組0、7、14次凍融樣品的Ct值之間無顯著差異(P>0.05)，而經(jīng)21、28次凍融后，樣品的Ct值顯著增加(P<0.05)；低濃度D組樣品經(jīng)0～21次凍融后，Ct值無顯著變化(P>0.05)，經(jīng)28次凍融后則顯著增加(P<0.05)。

3 討論

3.1 鴨疫里默氏桿菌熒光定量PCR檢測方法的構(gòu)建

鴨疫里默氏桿菌病又稱鴨傳染性漿膜炎，是由革蘭氏陰性病原菌鴨疫里默氏桿菌引起的慢性或急性敗血性疾病，病鴨表現(xiàn)出纖維素性心包炎、肝周炎等病理癥狀[6]，可引起鴨群接觸性傳染，主要侵害2～8周齡雛鴨，致死性較高[7]。一般將OmpA基因、motb基因[8]、tonB基因[9]、16SrRNA[10]作為鴨疫里默氏桿菌鑒定因子。其中，免疫原性外膜蛋白OmpA基因廣泛存在于目前已知的鴨疫里默氏桿菌菌株中，故常被用于鑒定鴨疫里默氏桿菌[11]。由于采用普通PCR方法進行擴增后仍需進行凝膠電泳分析，雖成本較低，但擴增產(chǎn)物易出現(xiàn)降解、污染，檢測結(jié)果不直觀，且易產(chǎn)生假陽性[12]。熒光定量PCR是實驗室常用的優(yōu)于普通PCR的實時定量PCR技術(shù)，其中染料法較探針法更經(jīng)濟、簡便，在擴增過程中能產(chǎn)生大量熒光信號進行實時監(jiān)測，具有更高的特異性和敏感性，可針對病料的DNA、RNA進行快速定量檢測[13]。本研究選用OmpA基因保守序列設(shè)計鴨疫里默氏桿菌熒光定量PCR鑒定的引物，經(jīng)驗證，所設(shè)計引物僅針對鴨疫里默氏桿菌DNA出現(xiàn)單一的112 bp目的條帶(凝膠電泳)和特異性擴增曲線(熒光定量PCR)，具有良好的特異性。

表5 鴨疫里默氏桿菌DNA樣品經(jīng)反復(fù)凍融后熒光檢測Ct值的變化

用ddH2O將鴨疫里默氏桿菌DNA原液依次經(jīng)101、102、103倍梯度稀釋后進行熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)隨著DNA濃度的下降，循環(huán)閾值(Cycle threshold，Ct值)逐漸升高，表明DNA濃度越高則檢測靈敏度越好，與以往研究結(jié)果[14]相符。

3.2 凍存溫度對鴨疫里默氏桿菌DNA的影響

有研究表明，凍存時間對于DNA的完整性、純度無影響，但會造成DNA數(shù)量上的損失[15]。張淑雅等[16]研究表明，DNA樣品降解效率與時間呈正相關(guān)，常溫條件下降解速度快于4 ℃ 、-20 ℃的。DNA的降解主要受DNA酶的影響，溫度越低，酶活性越差，故降解越慢。另有研究表明，超過1周后，DNA于室溫保存比4 ℃保存濃度下降更明顯[17]。宋艷紅等[18]研究表明，人乳頭瘤病毒DNA在4 ℃條件下保存2周則DNA水平相對穩(wěn)定，4周后則低濃度組的DNA水平出現(xiàn)降低甚至消失的現(xiàn)象。在本研究中，保存溫度對不同濃度的鴨疫里默氏桿菌DNA濃度造成不同程度的影響，保存于常溫的DNA樣品出現(xiàn)明顯的降解，尤其低濃度組DNA樣品的Ct值于21 d后出現(xiàn)較大提高，與莊養(yǎng)林等的研究結(jié)果[19]相符。故建議鴨疫里默氏桿菌DNA樣品的保存溫度應(yīng)低于4 ℃，長期保存則應(yīng)選擇-20 ℃或-80 ℃。

3.3 反復(fù)凍融對鴨疫里默氏桿菌DNA的影響

裸露的DNA雙鏈化學(xué)特性較為穩(wěn)定，但是其物理結(jié)構(gòu)容易破碎，在力學(xué)作用下DNA序列將不再完整，導(dǎo)致PCR擴增效率下降[20]。反復(fù)凍融造成固液體積交替，冰晶的形成導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)產(chǎn)生力學(xué)損傷。本研究中鴨疫里默氏桿菌DNA樣品濃度隨凍融次數(shù)的增加而下降，Ct值反之，與王韻淞等[21]的研究結(jié)果一致。范念斯等[22]的研究表明，DNA樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融，平行保存于-20 ℃條件下的DNA樣品可避免DNA濃度發(fā)生劇烈變化。王亨莉等[23]的研究表明，較高濃度的DNA樣品經(jīng)21次反復(fù)凍融將不影響定量結(jié)果，而低濃度組則出現(xiàn)較大波動。本研究發(fā)現(xiàn)，較高濃度鴨疫里默氏桿菌DNA樣品的Ct值未受凍融次數(shù)的影響，保存于-20、-80 ℃中均可；而較低濃度DNA樣品則在21次、28次凍融后出現(xiàn)降解，且更適合保存于-20 ℃。而洪恩宇等指出，保存于-80 ℃冰箱的較高濃度的RNA經(jīng)多次反復(fù)凍融后會因濃度原因而出現(xiàn)降解效率的不明顯[24]。故濃度對于反復(fù)凍融情況下核酸完整性保存具有關(guān)鍵性影響。

4 結(jié)論

本研究根據(jù)OmpA基因保守序列成功建立了鴨疫里默氏桿菌熒光定量PCR鑒定方法， 鴨疫里默氏桿菌DNA樣品保存溫度應(yīng)低于4 ℃，且低濃度DNA樣品應(yīng)避免21次以上的反復(fù)凍融。