連利霞，孔存權(quán)，劉鴻雁，朱偉彥

(河南省人民醫(yī)院/鄭州大學(xué)人民醫(yī)院 腫瘤中心，河南 鄭州 450003)

新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)是由新型冠狀病毒感染引起的肺炎[1]。多數(shù)COVID-19患者預(yù)后較好，少數(shù)可進(jìn)展為重癥或危重癥，甚至出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、多器官功能障礙綜合征等嚴(yán)重并發(fā)癥，預(yù)后差[2]。因此，預(yù)防COVID-19進(jìn)展為重癥或危重癥是提高治愈率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。老年及合并慢性基礎(chǔ)疾病是影響預(yù)后的主要因素，但仍難完全解釋COVID-19患者病情加重和死亡的原因。有研究提出，免疫功能紊亂和細(xì)胞因子風(fēng)暴可能扮演著更重要的角色[3]。目前多以外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行性下降、炎癥因子水平進(jìn)行性上升等免疫炎癥指標(biāo)作為重型或危重型的臨床預(yù)警指標(biāo)。有研究探討了COVID-19患者的免疫功能變化[4]，但目前比較不同類型患者的細(xì)胞免疫功能的研究較少?；诖耍狙芯糠治黾?xì)胞免疫功能指標(biāo)與COVID-19患者病情的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集2020年1月22日至3月9日河南省人民醫(yī)院收治的51例COVID-19患者的臨床資料，包括性別、年齡、初發(fā)癥狀、基礎(chǔ)疾病、分型、實(shí)驗(yàn)室檢查等指標(biāo)。根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》對患者進(jìn)行臨床分型。其中普通型23例，重型17例，危重型11例。將普通型患者納入對照組(23例)，將重型或危重型患者納入觀察組(28例)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：采集鼻咽分泌物標(biāo)本，經(jīng)嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)檢測確診。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①入院前確診，入院時(shí)結(jié)果已轉(zhuǎn)陰；②資料缺失。

1.3 觀察指標(biāo)采集患者靜脈血約5 mL至EDTA抗凝管中。(1)采用Sysmex XN-1000自動(dòng)血液分析儀及配套試劑檢測C反應(yīng)蛋白(C reactive protein，CRP)、血常規(guī)，包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)(white blood cell count，WBC)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(neutrophilic granulocytes，NEU)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)(monocyte count，MONO)、總淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(lymphocyte count，LYM)。(2)采用FACSCANTO流式細(xì)胞儀(美國BD公司)檢測T淋巴細(xì)胞亞群，試劑盒購自青島瑞斯凱爾生物科技有限公司。操作方法：①于標(biāo)本管中加入25 μL緩沖液和25 μL標(biāo)本，離心10 min，轉(zhuǎn)速為3 000 r·min-1，離心半徑為15 cm；②加入捕獲微球抗體、檢測抗體各25 μL，震蕩孵育2 h，加入25 μL SA-PE，震蕩孵育30 min；③加入洗滌緩沖液離心5 min，轉(zhuǎn)速為1 800 r·min-1，離心半徑15 cm，倒出液體，加入配制洗滌緩沖液，渦旋10 s，上機(jī)檢測，檢測指標(biāo)包括T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、NK細(xì)胞計(jì)數(shù)、B細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD4+T淋巴細(xì)胞比率、CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD8+T淋巴細(xì)胞比率、CD3+T淋巴細(xì)胞比率、CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值、CD19+細(xì)胞比率、CD3-CD16+CD56+細(xì)胞比率等免疫細(xì)胞亞群。

2 結(jié)果

2.1 一般資料和細(xì)胞免疫指標(biāo)與對照組比較，觀察組年齡較大，合并基礎(chǔ)疾病占比、WBC、NEU、CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值較高，CD8+T淋巴細(xì)胞比率較低(P<0.05)；兩組性別、MONO、LYM、CRP、T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、NK細(xì)胞計(jì)數(shù)、B細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD3+T淋巴細(xì)胞比率、CD4+T淋巴細(xì)胞比率、CD19+細(xì)胞比率、CD3-CD16+CD56+細(xì)胞比率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料、細(xì)胞免疫指標(biāo)比較

表1(續(xù))

2.2 細(xì)胞免疫功能與COVID-19患者病情的相關(guān)性以兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)的指標(biāo)為自變量，以患者病情嚴(yán)重程度為因變量，采用logistic回歸模型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示未合并基礎(chǔ)疾病和較高的CD8+T淋巴細(xì)胞比率為保護(hù)因素，而較高的CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值為危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表2。

表2 COVID-19患者病情相關(guān)因素的logistic回歸分析

3 討論

SARS-CoV-2引發(fā)以呼吸系統(tǒng)感染為主要表現(xiàn)的傳染病，即為COVID-19。SARS-CoV-2主要通過飛沫和接觸傳播，傳染性較強(qiáng)，傳播速度快，人群普遍易感。人體免疫可分為固有免疫和適應(yīng)性免疫。T淋巴細(xì)胞參與適應(yīng)性免疫過程，T細(xì)胞分為CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞。CD4+細(xì)胞主要合成和分泌細(xì)胞因子，對免疫應(yīng)答起輔助和調(diào)節(jié)作用。CD8+細(xì)胞通過細(xì)胞毒作用特異性殺傷病毒等胞內(nèi)感染病原體所感染的靶細(xì)胞和體內(nèi)突變細(xì)胞。Wang等[5]研究表明，COVID-19患者淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)減少，SARS-CoV-2可能主要作用于淋巴細(xì)胞，且老年普通型COVID-19患者進(jìn)展為重癥的風(fēng)險(xiǎn)更高。CD4+/CD8+失衡、CD8+異常激活、調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞數(shù)目減少所致的免疫抑制效應(yīng)是感染性疾病發(fā)生的主要原因[6]。

本研究結(jié)果顯示，相對普通型患者，重癥或危重癥COVID-19患者除年齡較大、合并基礎(chǔ)疾病占比較高外，還表現(xiàn)為WBC、NEU水平升高，在T細(xì)胞亞群指標(biāo)方面主要是CD8+細(xì)胞比率的下降和CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值的升高。這提示了重癥或危重癥COVID-19患者存在外周血炎癥細(xì)胞數(shù)量的增加和細(xì)胞免疫功能亢進(jìn)。細(xì)胞免疫功能亢進(jìn)可能是導(dǎo)致COVID-19病情加劇的病理機(jī)制之一。通過本研究結(jié)果可見，普通型COVID-19患者表現(xiàn)為明顯的免疫抑制狀態(tài)，這與SARS-CoV-2感染密切相關(guān)。人類免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、皰疹病毒、腺病毒等感染均會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫功能受損[7-8]。針對冠狀病毒感染導(dǎo)致的嚴(yán)重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)的研究顯示，SARS患者在感染早期會(huì)出現(xiàn)WBC、粒細(xì)胞計(jì)數(shù)的下降和粒細(xì)胞百分比的升高以及CD3+、CD4+和CD8+細(xì)胞絕對數(shù)的下降，而細(xì)胞免疫功能會(huì)隨著病情的好轉(zhuǎn)逐漸改善[9-10]。COVID-19患者也呈現(xiàn)出了類似的變化趨勢。感染SARS-CoV-2后，患者處于免疫抑制狀態(tài)，故在疾病治療中應(yīng)高度重視針對繼發(fā)性感染的預(yù)防和控制工作。

本研究結(jié)果顯示，較低的CD8+T淋巴細(xì)胞比率和較高的CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值會(huì)提升普通型COVID-19進(jìn)展為重癥或危重癥的風(fēng)險(xiǎn)。低CD8+T淋巴細(xì)胞比率可能提示著肺等靶器官中的淋巴細(xì)胞浸潤和免疫損害程度加劇。在病毒感染人體細(xì)胞后，機(jī)體能夠激活自身免疫系統(tǒng)來清除細(xì)胞內(nèi)的病毒，甚至能通過細(xì)胞自噬來直接吞噬、降解入侵的病毒[11]。針對COVID-19患者的尸檢結(jié)果顯示：患者的肺泡腔內(nèi)可見漿液、纖維蛋白性滲出物及透明膜形成，肺泡隔血管充血、水腫，肺組織可出現(xiàn)灶性出血、壞死、間質(zhì)纖維化，滲出細(xì)胞以單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主，可見淋巴細(xì)胞浸潤；脾明顯縮小，脾和淋巴結(jié)內(nèi)的CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯減少；骨髓三系細(xì)胞數(shù)量減少。這與SARS的細(xì)胞免疫功能變化類似[12-13]。因此，COVID-19患者一旦出現(xiàn)外周血CD8+T淋巴細(xì)胞比率的下降，則提示著肺內(nèi)免疫損傷程度的加劇，病情進(jìn)展至重癥或危重癥的風(fēng)險(xiǎn)上升。

CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值的失衡會(huì)導(dǎo)致機(jī)體處于免疫過激狀態(tài)。在免疫過激狀態(tài)下，免疫細(xì)胞會(huì)分泌更高水平的干擾素、白細(xì)胞介素、趨化因子、集落刺激因子、腫瘤壞死因子等炎癥因子。以上炎癥因子又會(huì)趨化和激活更多的免疫細(xì)胞并分泌更多的細(xì)胞因子。這種正反饋循環(huán)最終形成細(xì)胞因子風(fēng)暴，導(dǎo)致肺內(nèi)大量正常細(xì)胞被殺死，直到患者出現(xiàn)呼吸衰竭甚至死亡。這種細(xì)胞因子風(fēng)暴也是導(dǎo)致SARS、甲型H1N1流感、禽流感等呼吸道傳染性疾病患者發(fā)生急性呼吸窘迫綜合征及預(yù)后不良的重要因素[14]。在本研究中，CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值升高可能是CD8+T淋巴細(xì)胞下降所致。一項(xiàng)針對武漢大學(xué)中南醫(yī)院41例 COVID-19患者的研究顯示，COVID-19重癥率和病死率分別高達(dá)32%、15%，明顯高于武漢地區(qū)平均水平，這可能與該研究中發(fā)生細(xì)胞因子風(fēng)暴的患者占比較高有關(guān)[15]。糾正T淋巴細(xì)胞亞群失衡，從而減少細(xì)胞因子風(fēng)暴的產(chǎn)生成為了治療COVID-19的新思路。近期先后出現(xiàn)了采用間充質(zhì)干細(xì)胞移植術(shù)[16]及應(yīng)用腎素-血管緊張素系統(tǒng)抑制劑[17]調(diào)節(jié)COVID-19患者免疫功能的研究。總之，在COVID-19的治療中，應(yīng)重視免疫過激狀態(tài)，采取有效的手段調(diào)節(jié)患者的免疫功能，以預(yù)防和控制細(xì)胞因子風(fēng)暴的發(fā)生，阻止病情向重癥或危重癥進(jìn)展。

合并基礎(chǔ)疾病、CD8+T淋巴細(xì)胞比率、CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值是重癥或危重癥COVID-19發(fā)生的影響因素。對合并基礎(chǔ)疾病的患者進(jìn)行積極治療并采取有效手段調(diào)節(jié)患者的免疫功能，有助于促進(jìn)患者康復(fù)。