許春娜，李曉，湯昱，張磊，王秀芳

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種慢性的氣道炎癥性疾病，具有異質性的特點。對國內外兒童群體研究中發(fā)現，哮喘患病率是逐年增高的，這將給患兒家庭及社會帶來沉重的負擔[1]，吲哚胺2，3雙加氧酶(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)在人和動物的組織中低水平表達，為色氨酸代謝的限速酶。色氨酸在參與變態(tài)反應性疾病發(fā)生過程中起關鍵作用[2]，是免疫耐受機制的重要參與者，IDO作為色氨酸的限速酶，其表達水平有重要意義[3]。γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)具有免疫調節(jié)、抗病毒等多種活性，其是由分泌蛋白質組成[4]。通過調控嗜酸性粒細胞、肥大細胞等細胞活性參與呼吸道病情進展過程[5]。ünüvar等[6]在對過敏性疾病的研究中證實，IDO隨著IFN-γ的刺激而增加。故本文檢測小鼠肺組織中IDO、IFN-γ的水平，闡述其在哮喘小鼠體內的表達及相關關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇6周齡SPF級雌性BALB/c小鼠21只，體質量18～23 g，由河南省實驗動物中心提供，生產許可證號SCXK(豫)2010-0002。

1.2 試劑 塵螨提取物(丹麥ALK公司)，Anti-Indoleamine 2，3-dioxygenase antibodyab(ABCAM公司)，eECL Western Blot Kit試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)，ELISA試劑盒(上海森雄科技有限公司)。

1.3 小鼠哮喘模型的建立及實驗分組 按隨機數字表法將21只小鼠分為對照組、干預組、哮喘組3組，每組7只。哮喘組及干預組小鼠致敏：將含2 000 U/mL的塵螨提取液100 μL(每毫升塵螨提取液中氫氧化鋁含2%)第1天皮下注射，第3、5、7天腹腔注射，將含4 000 U/mL的塵螨提取液50 μL于第9、11、13天腹腔注射；對照組小鼠以相同方法、相同劑量生理鹽水替代致敏。哮喘組小鼠激發(fā)：先用0.3%戊巴比妥0.3 mL以腹腔注射的方法麻醉小鼠后以含4 000 U/mL塵螨提取液50 μL/次于第15、16、17天滴鼻激發(fā)小鼠，每日1次。干預組小鼠激發(fā)：用布地奈德混懸液2 mL霧化吸入30 min后進行滴鼻，余同哮喘組；對照組小鼠激發(fā)：用相同劑量的生理鹽水滴鼻。

1.4 小鼠支氣管肺泡灌洗術及處理肺標本 將小鼠于末次激發(fā)24 h后進行麻醉，取左肺，置于-80 ℃冰箱保存，行右支氣管插管后灌洗，重復灌洗3次，最后可回抽出1.0～1.5 mL的生理鹽水，回收率>80%，轉移至EP管中，離心10 min，取上清液用于細胞因子檢測，細胞沉淀重懸后計算細胞總數，取右肺組織，石蠟包埋切片，分別行HE染色及免疫組織化學染色。顯微鏡下看同級支氣管周圍炎性細胞及支氣管壁的改變；在高倍鏡(×40)下查看及測定陽性細胞蛋白表達，結果以其單位面積累積光密度值表示。

1.5 ELISA法測IFN-γ水平 將血清及支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)上清液從-20 ℃冰箱取出，打開IFN-γ ELISA試劑盒，嚴格按照說明書操作。

1.6 Western blot法測IDO蛋白表達 取1 g左肺組織提取蛋白，研磨處理1～2 min后編號，孵育30 min并進行離心，收集上清液，置于-20 ℃冰箱保存。用考馬斯亮藍G-250和牛血清白蛋白定量，分裝，置于-20 ℃冰箱備用，配制15%的聚丙烯酸胺凝膠，將溶液注入玻璃板夾層中聚合30 min，100 ℃水浴5 min、離心，加點樣孔和蛋白Marker后進行電泳?？捡R斯亮藍G-250、麗春紅染色液進行染色，脫色至蛋白條帶清晰，將膠浸入轉膜緩沖液中轉膜，完成后加脫脂奶粉封閉，置搖床上搖動2 h，然后稀釋的一抗中4 ℃過夜，棄含一抗的封閉液，進行二抗的孵育后曝光顯影。

2 結果

2.1 肺組織病理學 哮喘組：可見以嗜酸性粒細胞、淋巴細胞為主的大量炎細胞浸潤，小鼠氣道壁厚度增加，氣道內有上皮細胞脫落及杯狀細胞化生，并有膠原纖維增生。干預組與哮喘組小鼠比較程度較輕。而對照組小鼠則可見散在的炎細胞、氣道壁厚度正常，杯狀細胞無化生表現。見圖1。哮喘組小鼠氣道壁厚度高于干預組及對照組，干預組高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

圖1 3組小鼠肺組織病理變化(蘇木精-伊紅染色，×40)

表1 3組小鼠氣道壁厚度

2.2 3組小鼠BALF細胞計數及分類比較 見表2。哮喘組BALF中細胞總數及分類高于干預組及對照組，干預組高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 3組小鼠BALF中細胞計數及分類比較

2.3 3組小鼠IDO蛋白表達量比較 免疫組織化學染色結果顯示陽性細胞區(qū)為褐色，主要分布在氣管壁、小血管壁周圍，見圖2。測定陽性區(qū)積分光密度值表示IDO蛋白表達量，哮喘組表達量低于干預組及對照組，干預組表達量低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

圖2 3組小鼠肺組織IDO陽性細胞染色結果(免疫組織化學染色，×40)

表3 3組小鼠IDO蛋白表達量

2.4 3組小鼠血清及BALF液中IFN-γ水平比較 見表4。哮喘組血清及BALF液中IFN-γ水平低于干預組和對照組，干預組低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表4 3組小鼠血清中及BALF中IFN-γ水平比較

2.5 小鼠肺組織中IDO蛋白表達結果 見圖3。哮喘組IDO灰度值低于干預組及對照組，干預組低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

圖3 各組小鼠肺組織中IDO的蛋白表達量

表5 3組小鼠肺組織中IDO灰度值

2.6 相關性分析 IFN-γ水平在血清中與BALF中呈正相關(r=0.981，P<0.01)；肺組織內IDO蛋白的表達與IFN-γ水平在血清中及BALF中均呈正相關(r=0.956，0.963，P<0.01)，見圖4。

圖4 IDO表達與IFN-γ水平的相關性分析

3 討論

研究發(fā)現在氣道重構過程中發(fā)揮重要作用的有嗜酸粒細胞、淋巴細胞和中性粒細胞等及其分泌的細胞因子[7]。文中以塵螨提取液致敏小鼠的方法建立支氣管哮喘模型，肺組織顯微鏡下可見哮喘組以嗜酸性粒細胞、淋巴細胞為主的大量炎細胞浸潤，BALF中細胞總數、嗜酸性粒細胞數、淋巴細胞數高于其他兩組。

IFN-γ影響非IgE介導的氣道炎癥基因[8]，其水平變化與支氣管哮喘發(fā)生和發(fā)展存在相關性[9]。本實驗同時檢測小鼠血清及BALF中IFN-γ的水平，利用兩組數據進行比較以便更好的反應數據的真實性。IDO作為限速酶在體內催化色氨酸分解代謝[10]，參與誘導機體的免疫耐受途徑。在動物實驗研究中觀察到哮喘小鼠IDO在蛋白質和mRNA水平上都有明顯的低表達[11]。在臨床研究中觀察到健康兒童的IDO水平高于哮喘患兒，哮喘患兒誘導痰和外周血中IDO表達明顯降低，提示IDO活性可抑制氣道過敏反應，在過敏性哮喘的致病機制中具有保護作用[12-13]。

IFN-γ是干擾素家族成員，而研究發(fā)現其是誘導IDO表達的最強刺激因子之一[14]。涂媛媛等[15]加入不同濃度的IFN-γ在早孕絨毛和蛻膜組織中研究發(fā)現，IFN-γ通過調節(jié)IDO的表達可使實驗對象母胎耐受，IFN-γ的濃度與IDO的表達呈正相關，IFN-γ上調IDO的表達，從而保護胎兒免受母體的排斥。Oh等[16]在實驗中發(fā)現IFN-γ以激活信號轉導和轉錄激活因子1來增加IDO的表達。Zhang等[17]研究中顯示IFN-γ能顯著激活角質形成細胞的IDO表達。多位學者的研究均說明IFN-γ的水平與IDO表達有關，故在本實驗中檢測小鼠體內IDO與IFN-γ的水平來闡述兩者的關系，結果顯示兩者在小鼠體內是呈正相關，與上述研究中的結果是一致的。另有研究發(fā)現抑制IFN-γ受體并消除IFN-γ的作用，會抑制IFN-γ誘導IDO1的表達[18]。利用IFN-γ治療后，間充質干細胞中IDO的表達增加，在絲素蛋白納米纖維板上生長的間充質干細胞在IFN-γ處理后顯示IDO表達增強[19]。本研究中結果與上述觀點也一致。且最新研究發(fā)現一氧化氮敏感性效應機制是IFN-γ誘導IDO表達的機制之一[20-21]。

有研究者把免疫刺激序列寡脫氧核苷酸注射哮喘小鼠體內，發(fā)現Th2細胞反應明顯減輕，證實是通過增強樹突狀細胞表達IDO的結果[22]。在本文中運用Western blot法及免疫組織化學法檢測小鼠體內IDO的表達，實驗數據均表明IDO在哮喘組是低表達，當IDO表達減少時使免疫耐受功能減弱或缺如，易于支氣管哮喘的形成或使其加重。