羅 樊，周建平，蔡樹瓊，鄭雪蓮，曾 翔，蔡光澤*，張 勇*

(1.西昌學院農(nóng)業(yè)科學學院，四川 西昌 615013；2.電子科技大學生命科學與技術(shù)學院，信息生物學中心, 四川 成都 610054)

【研究意義】水稻(OryzasativaL.)是主要糧食作物之一，全球約1/2的人口將其作為主食。在中國，水稻更是保障糧食安全和實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要糧食作物[1]。預計2030年世界人口將達到85億，這使世界范圍內(nèi)水稻產(chǎn)量提高的育種計劃面臨著巨大壓力。傳統(tǒng)水稻育種主要通過雜交和回交的方式實現(xiàn)優(yōu)良基因的聚合，存在周期長、效率低和工作量大等缺點，而基因編輯技術(shù)避免了傳統(tǒng)突變體獲得過程中的基因連鎖和滲透現(xiàn)象，具有育種周期較短、選育針對性強等特點，能夠精準、快速地培育優(yōu)質(zhì)水稻[2-3]，為水稻育種帶來新的契機?！厩叭搜芯窟M展】目前，作為新一代基因編輯技術(shù)的CRISPR/Cas9技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用到水稻[4]、小麥[5]、玉米[6]、大豆[7]、高粱[8]、棉花[9]、番茄[10-11]、甘蔗[12]等作物的品種改良中。CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)成為水稻基因編輯最簡單、經(jīng)濟和有效的技術(shù)，能在水稻基因組水平進行高效定向編輯[13-21]。單株水稻產(chǎn)量由單株分蘗數(shù)、每穗粒數(shù)和粒重3個因素構(gòu)成[22-23]。目前，已經(jīng)鑒定出多個影響這,3個產(chǎn)量構(gòu)成因素的基因,例如MONOCULM 1 (MOC1)、TEOSINTE BRANCHED1 (OsTB1)、和IDEAL PLANT ARCHITECTURE1 (IPA1)控制水稻的分蘗數(shù)[24-27]；GRAIN NUMBER 1a (Gn1a)、DROUGHT AND SALT TOLERANCE (DST)、IPA1和Grains.Height.Date-7 (Ghd7) 調(diào)控水稻每穗粒數(shù)[24-25,27-29]；Grain Size(GS3), Grain Weight (GW2, GW5), Squamosa Promoter Binding Protein-like 16 (OsSPL16), Ser/Thr phosphatase (OsPPKL1)和GNAT-like Protein (OsglHAT1) 等對水稻谷粒大小起到調(diào)控作用[30-38]。Li 等[39]通過 CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除水稻中的GS3基因，其T2代籽粒表現(xiàn)出粒長和粒重增加，水稻的產(chǎn)量提高。Song等[31]研究表明GW2是負控制水稻籽粒寬度和粒重的主效基因；Ashikari等[28]研究表明GN1a基因編碼的是一種降解細胞分裂素的酶，該基因表達減弱會引起花序分生組織中細胞分裂素的積累，進而增加穎花數(shù)量和水稻穗粒數(shù)。Zhou等[40]運用CRISPR/Cas9 技術(shù)對水稻OsGS3、OsGW2和OsGN1a三基因進行敲除，獲得GS3、GW2和GN1a三基因敲除突變體，該水稻突變體在溫室中籽粒的粒長、粒寬、千粒重、穗長和單穗重均明顯增加，顯現(xiàn)出巨大的育種潛力?！颈狙芯壳腥朦c】但突變體在田間的主要農(nóng)藝性狀、碾米品質(zhì)、理化品質(zhì)以及食味值等是否改變尚需研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】因此，本研究對水稻吉粳809的OsGS3、OsGW2和OsGN1a三基因定向聚合敲除突變體在田間的主要農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量和品質(zhì)進行研究，為OsGS3、OsGW2和OsGN1a三基因定向聚合編輯在育種上的應(yīng)用提供實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

不含轉(zhuǎn)基因成分的水稻吉粳809的OsGS3、OsGW2和OsGN1a三基因定向敲除突變體由電子科技大學生命科學與技術(shù)學院植物基因組工程實驗室提供，突變體編號為J50-2(OsGS3:+1 bp/+1 bp，OsGW2:+1 bp/+1 bp，OsGN1a:-32 bp/-32 bp)和J47-1(OsGS3:+1 bp/+1 bp，OsGW2:-1 bp/-1 bp，OsGN1a:+1 bp/+1 bp)，對照試驗材料為野生型材料吉粳809，編號為WT，由吉林省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所林秀云研究員提供。

1.2 試驗地點

水稻種植實驗基地位于西昌市西鄉(xiāng)，土壤肥力條件良好，水源充足，排灌方便，周圍無大型的遮擋物，光照充分。實驗地外圍1000 m內(nèi)無水稻及其它禾本科作物種植。

1.3 試驗設(shè)計

采用隨機區(qū)組試驗，3次重復。試驗材料J50-2、J47-1和WT于2019年4月12日播種，采用地膜秧盤育秧方式，每穴播種1粒。移栽日期為2019年5月25日，移栽時基本苗均為1苗。移栽小區(qū)面積為13.30 m2，小區(qū)長寬分別為6.19和2.15 m。株行距為19.55和16.73 cm，小區(qū)間間距33.30 cm，四周設(shè)1.00 m保護行。于移栽后7 d施用春果肥160 kg/667m2(總養(yǎng)分N+P2O5+K2O≥10 %、有機質(zhì)≥45 %、腐植酸≥10 %、有效活菌數(shù)≥0.2億/g)。成熟收獲日期為2019年9月22日，田間管理按照當?shù)厝粘７绞竭M行。

1.4 測定指標

水稻成熟后，每個小區(qū)隨機選取10株進行株高和有效分蘗數(shù)測定，并將隨機選取的10株水稻分別置于室內(nèi)自然晾干，測定穗長、每穗總粒數(shù)、每穗實粒數(shù)和結(jié)實率，。將谷粒存放3個月后，參照國家標準《GB/T17891-1999 優(yōu)質(zhì)稻谷》測定千粒重、谷粒長度、谷粒寬度、糙米率、精米率、整精米率、堊白粒率。蛋白質(zhì)含量參照國家標準《GB5009.5-2016》第三法測定。直鏈淀粉含量參照國家標準《GB/T15683-2008》進行測定。大米食味值采用大米食味計(JSWL，日本佐竹公司)測定。堊白度采用大米外觀品質(zhì)檢測儀(JMWT12，日本佐竹公司)測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010和IBM SPSS Statistics 25進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsGS3、OsGW2和OsGN1a三基因敲除對吉粳809農(nóng)藝性狀的影響

野生型吉粳809和J47-1株系、J50-2株系的農(nóng)藝性狀分析表明，突變體J47-1與J50-2的平均株高比野生型分別增加3.99 %和5.99 %，均表現(xiàn)為極顯著差異(圖1-a，圖1-d)。突變體J47-1與J50-2的平均粒長比野生型增加20.63 %和17.33 %，均呈極顯著差異(圖1-b，圖1-k)。突變體J47-1與J50-2的平均粒寬比野生型分別增加11.66 %和10.79 %，均表現(xiàn)為極顯著差異(圖1-b，圖1-j)。突變體J47-1與J50-2的平均穗長比野生型分別增加9.27 %和9.04 %，均表現(xiàn)為極顯著差異(圖1-c，圖1-f)。突變體J47-1與J50-2的平均分蘗數(shù)分別為8.53和8.83個，比野生型減少23.84 %和21.16 %，均呈極顯著差異(圖1-e)。突變體J47-1與J50-2的平均每穗總粒數(shù)與野生型相比均表現(xiàn)為增加，達到極顯著差異(圖1-g)。但突變體J47-1與J50-2的每穗實粒數(shù)比野生型僅增加3.65 %和3.68 %，差異不顯著(圖1-h)。突變體J47-1與J50-2的平均結(jié)實率比野生型分別降低7.68 %和8.49 %，均呈極顯著差異(圖1-i)。突變體J47-1與J50-2比野生型千粒重增加53.75 %和49.31 %，均呈極顯著差異(圖1-l)。GS3、GW2和GN1a三基因敲除使吉粳809的基本農(nóng)藝性狀的株高、穗長、每穗總粒數(shù)、每穗實粒數(shù)、粒長、粒寬和千粒重均有所提高，而每株分蘗數(shù)和結(jié)實率降低。

2.2 三基因敲除對吉粳809產(chǎn)量的影響

GS3、GW2和GN1a三基因敲除植株J47-1和J50-2產(chǎn)量比野生型分別增產(chǎn)12.62 %和15.78 %，均呈顯著差異(圖1-m)。表明GS3、GW2和GN1a三基因敲除使吉粳809的產(chǎn)量顯著提高。

2.3 三基因敲除對吉粳809碾米品質(zhì)的影響

GS3、GW2和GN1a的糙米率野生型相比無顯著差異(圖2-b)。突變體J47-1和J50-2的精米率比野生型分別減少4.09 %和2.78 %，其中J47-1與野生型差異顯著，而J50-2與野生型差異達極顯著(圖2-c)。突變體J47-1和J50-2的整精米率比野生型低32.83 %和22.86 %，均呈極顯著差異(圖2-d)。突變體J47-1和J50-2的堊白率分別比野生型高80 %和84 %，均達到極顯著差異(圖2-e)。突變體J47-1和J50-2的堊白度比野生型分別高16.37 %和12.20 %，均達到極顯著差異(圖2-f)。表明，GS3、GW2和GN1a三基因敲除使吉粳809的精密率和整精米率顯著降低，堊白粒率和堊白度顯著增高，而對糙米率影響不大。

2.4 三基因敲除對吉粳809理化品質(zhì)和食味值的影響

GS3、GW2和GN1a三基因敲除突變體J47-1和J50-2的直鏈淀粉與野生型的差異不顯著(圖3-a)。

蛋白質(zhì)含量上，J47-1和J50-2與野生型的蛋白質(zhì)含量差異未達顯著水平(圖3-b)。J47-1、J50-2和野生型的食味值差異也也未達顯著水平(圖3-c)。表明，GS3、GW2和GN1a三基因敲除對吉粳809的直鏈淀粉含量、蛋白質(zhì)含量和食味值均影響不大。

3 討 論

隨著水稻全基因組測序完成，大量調(diào)控水稻重要性狀的基因的克隆與鑒定，將控制重要性狀的基因應(yīng)用于育種實踐的需求越來越迫切。GS3、GW2和GN1a三基因分別是水稻粒長、粒寬和每穗粒數(shù)的負調(diào)控因子，對水稻產(chǎn)量因素調(diào)控起著重要作用[28,31,39]。GS3、GW2和GN1a三基因的敲除對水稻吉粳809的田間基本農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量有不同程度的影響。與GS3、GW2和GN1a三基因的敲除獲得的突變體與野生型相比，每穗總粒數(shù)、穗長、粒長、粒寬和千粒重均顯著增加，達到差異極顯著水平，其中每穗總粒數(shù)增加13.99 %～15.57 %，穗長增加9.04 %～9.27 %，粒長和粒寬分別增加17.33 %～20.63 %和10.79 %～11.66 %，千粒重增加49.31 %～53.75 %，該結(jié)果與Zhou等[40]的研究結(jié)果基本一致。另外本研究發(fā)現(xiàn)，突變體的每穗總粒數(shù)增加，但是結(jié)實率卻顯著下降，使每穗實粒數(shù)僅增加了3.65 %～3.68 %，且差異未到達顯著水平。分蘗也減少21.16 %～23.84 %，差異達到極顯著水平。而在Zhou等[40]的研究中卻未見結(jié)實率和分蘗數(shù)下降的報道，造成這些現(xiàn)象的可能原因是本實驗在大田環(huán)境下，植株與植株間相互競爭有限的肥力、陽光和CO2等資源造成。本研究中突變體的株高增加3.99 %～5.99 %，且差異達到極顯著水平，而在Zhou等[40]的研究，川農(nóng)香粳(CNXJ)的GS3、GW2、GN1a三基因敲除突變體與野生型相比卻表現(xiàn)出株高顯著降低的現(xiàn)象，這可能是2個不同背景水稻品種的基因相互作用產(chǎn)生的，具體原因有待進一步研究。雖然水稻產(chǎn)量三要素中每穗實粒數(shù)和粒重表現(xiàn)出增加，分蘗表現(xiàn)出減少，但最終產(chǎn)量增產(chǎn)達到12.62 %～15.78 %，且差異達到極顯著水平?？梢奊S3、GW2和GN1a三基因敲除方法在水稻增產(chǎn)中有巨大潛力。

GS3、GW2和GN1a三基因的敲除對吉粳809的品質(zhì)有較大影響。在碾米品質(zhì)方面，與突變體野生型相比，在糙米率方面無顯著差異，但是精米率和整精米率卻降低，其中精米率下降2.78 %～4.09 %，而整精米率卻下降了22.86 %～32.83 %，且差異都達到顯著水平。而整精米率是判斷優(yōu)質(zhì)米標準的重要指標，所以提高水稻碾米的整精米率是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)米的必要途徑[41]。因而突變體的碾米品質(zhì)劣于野生型。在外觀品質(zhì)方面，突變體的堊白粒率和堊白度相比野生型分別增加80.00 %～84.00 %和12.20 %～16.37 %，且差異達到極顯著水平。產(chǎn)生這種差異的原因可能是在水稻灌漿期，由于突變體水稻籽粒變大，胚乳沒有積累足夠的淀粉，導致淀粉粒形狀、大小不規(guī)則，淀粉粒排列不緊密產(chǎn)生空隙，從而導致堊白度增加，堊白粒率變高。而堊白粒率和堊白大小又和精米率和整精米率成極顯著負相關(guān)[42]，因而堊白粒率的增加又極有可能是導致突變體精米率和整精米率下降的原因。雖然突變體的外觀品質(zhì)要劣于野生型。但在理化品質(zhì)方面，J50-2和J47-1的直鏈淀粉含量和蛋白質(zhì)含量都與對照J809(WT)差異不大。在食味值方面，突變體和野生型差別也不大。

4 結(jié) 論

GS3、GW2和GN1a三基因敲除突變體與野生型相比，在株高、分蘗、穗長、穗粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重等田間農(nóng)藝性狀上都有不同程度的變化，產(chǎn)量表現(xiàn)出明顯增加，因而GS3、GW2和GN1a三基因敲除模式在水稻增產(chǎn)中蘊含巨大潛力。但是其外觀品質(zhì)中的堊白粒率和堊白度極顯著增加，碾米品質(zhì)中的精米率和整精米率又表現(xiàn)出極顯著降低，使得該方法下獲得的整精米產(chǎn)量和品質(zhì)都會有所下降，因而該方法不適合用在以精米作為商品出售的品種改良中。但是由于其理化品質(zhì)中的直鏈淀粉含量、蛋白質(zhì)含量以及食味值變化不明顯，因而該方法用于以糙米(如紅米和紫米)和米粉(如糯米粉)的形式作為商品的品種改良上擁有巨大的前途。