劉浩，穆蘭，黃志偉，楊瑞明，宮亮

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

喉鱗狀細(xì)胞癌(laryngal squamous cell carcinoma,LSCC)是頭頸部第二大常見(jiàn)的惡性腫瘤，僅次于鼻咽癌，病因至今仍不十分明了，其發(fā)生可能與吸煙、飲酒、病毒感染、放射線、性激素等因素有關(guān)。目前LSCC的治療方式主要是手術(shù)切除腫瘤結(jié)合放療和化療[1]。盡管治療技術(shù)有所提高，但LSCC的生存率并沒(méi)有顯著提高[2]。因此迫切需要尋找新的喉癌靶向治療，以延長(zhǎng)患者的生命并提高患者的生存質(zhì)量。

第二代測(cè)序技術(shù)又稱下一代測(cè)序技術(shù)(next generation sequencing,NGS),是近年來(lái)新興的一項(xiàng)比較成熟的轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序技術(shù)，可同時(shí)對(duì)數(shù)以百萬(wàn)的基因進(jìn)行序列測(cè)序并篩選差異表達(dá)的基因。miRNA是一類大小為19～25個(gè)核苷酸組成的非編碼小RNA分子，通過(guò)結(jié)合mRNA的3'端，導(dǎo)致mRNA沉默或降解影響其表達(dá)水平。研究表明miRNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。大量研究表明[3-4]，miRNA在喉癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的調(diào)控作用。本研究通過(guò)第二代測(cè)序技術(shù)與生物信息學(xué)方法的結(jié)合，并通過(guò)qRT-PCR在臨床樣本上去驗(yàn)證去篩選差異表達(dá)的miRNA，并期望對(duì)喉癌的臨床診斷、治療及預(yù)后提供重要信息。

1 材料與方法

1.1 材料

研究樣本：臨床收集2019年1月至2020年10月就診于錦州醫(yī)科大學(xué)并接受手術(shù)治療的33例患者的喉癌組織及癌旁組織(>0.5 cm)，所有患者在行手術(shù)前均未接受過(guò)放療和化療等治療方式。所有標(biāo)本切除后取部分喉癌及癌旁組織(與腫瘤安全界>0.5 cm)，迅速放入液氮中并轉(zhuǎn)-80 ℃冰箱保存。病理采集過(guò)程及后續(xù)實(shí)驗(yàn)均得到知情者同意以及醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),且為患者簽署保密協(xié)議。

主要試劑：TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen，美國(guó))；miRNeasy Mini Kit(總RNA抽提試劑盒，Qiagen，德國(guó))；RNA Nano 6000檢測(cè)試劑盒、SYBRGreenPCR試劑盒(羅氏公司)；文庫(kù)制備試劑盒(Illumin，美國(guó)) ；miR-106a-5p引物購(gòu)自北京擎科生物科技有限公司。儀器：分光光度儀(NanoPhotometer，美國(guó))；核酸樣品分析儀(Agilent Bioanalyzer2100，美國(guó))；第二代DNA測(cè)序系統(tǒng)(Illumina Hiseq4000，美國(guó))；實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)儀(Roche Light CyclerTM480，瑞士)。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及質(zhì)量鑒定

取喉癌及癌旁組織樣本各20 mg,按照TRIzol和miRNeasy Mini Kit試劑盒提供的說(shuō)明書要求提取總RNA，應(yīng)用NanoPhotometer分光光度儀對(duì)提取的總RNA進(jìn)行純度及濃度檢測(cè)，使用Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)的RNA Nano 6000檢測(cè)試劑盒評(píng)估RNA完整性、質(zhì)量及分布。

1.2.2 miRNA測(cè)序文庫(kù)的制備與測(cè)序

隨機(jī)抽取3例患者的喉癌組織及癌旁組織的總RNA進(jìn)行cDNA文庫(kù)的建立和測(cè)序。每個(gè)樣本總RNA量為3 μg用于下一代測(cè)序?qū)嶒?yàn)，采用Illumina的NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set制備cDNA文庫(kù)。將獲得的小RNA文庫(kù)在生物分析儀(Agilent，High Sensitivity DNA Kit)上進(jìn)行定量，合并，并使用3%凝膠BluePippin HT (Sage Science)提取適當(dāng)范圍的cDNA片段(140～160 bp)。文庫(kù)最終長(zhǎng)度范圍在安捷倫Bioanalyzer 2100 (Agilent)上用高靈敏度DNA試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證，僅包含部分微小RNA。最后用第二代DNA測(cè)序系統(tǒng)(Illumina Hiseq4000)對(duì)構(gòu)建獲得的cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，獲取的信息通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行分析，并對(duì)微小RNA序列進(jìn)行解碼和注釋[5]。

1.2.3 差異miRNA的生物信息學(xué)分析

首先使用Cutadapt軟件修剪并去除質(zhì)量評(píng)分較低的堿基序列和測(cè)序得到的序列3′和5′接頭，并去除短17 bp的修剪序列。然后對(duì)剩余序列質(zhì)量進(jìn)行驗(yàn)證(FastQC軟件),進(jìn)而初步完成對(duì)數(shù)據(jù)的篩選。 然后用miRDeep2 v2.0.0.7軟件的quantifier.pl模塊[6]和SeqBuster軟件的miraligner[7]使用默認(rèn)參數(shù)，以前體和成熟miRNA序列作為參考，對(duì)過(guò)濾后的reads進(jìn)行miRNA和isomiRNA定量 (miRBase v21)。利用“DESeq2”R中實(shí)現(xiàn)的負(fù)二項(xiàng)廣義線性模型，對(duì)3組喉癌和癌旁樣本中的miRNA進(jìn)行差異表達(dá)的分析，以P<0.05且log2(fold change,FC)>1判定為表達(dá)具有顯著差異性。通過(guò)繪制火山圖展現(xiàn)喉癌組織中有顯著性差異表達(dá)的miRNA,以紅點(diǎn)表示喉癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)，綠點(diǎn)表示表達(dá)顯著下降；取差異表達(dá)明顯的miRNA,通過(guò)繪制聚類分析熱圖，展現(xiàn)miRNA在不同組織樣本中的表達(dá)情況，紅色代表高表達(dá)，藍(lán)色代表低表達(dá)。通過(guò)繪制維恩圖，展現(xiàn)篩選出的miRNA在喉癌與癌旁組織的分布情況。

1.2.4 qRT-PCR

隨機(jī)挑取1種差異表達(dá)明顯的miRNA(miR-106a-5p)，采用qRT-PCR檢測(cè)miR-106a-5p在30例喉癌及癌旁組織中的表達(dá)水平，并對(duì)比二代測(cè)序結(jié)果。 將30組提取好的總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，然后進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)條件為：95 ℃ 60 s、95 ℃ 10 s、60 ℃ 15 s(40個(gè)循環(huán))。本反應(yīng)以U6 snRNA為內(nèi)參基因，應(yīng)用7500 System SDSSoftware軟件，統(tǒng)計(jì)ΔΔCt值，并以2-ΔΔCt值代表miR-106a-5p的表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 RNA抽提結(jié)果

經(jīng)NanoPhotometer分光光度儀檢測(cè)結(jié)果顯示，喉癌及癌旁組織中抽提獲得的RNA的D260 nm/D280 nm值均為1.8～2.1，說(shuō)明提取的總RNA有較好的純度。經(jīng)過(guò)Agilent Bioanalyzer 2100檢測(cè)結(jié)果顯示，RNA的RIN值≥6，數(shù)據(jù)表明提取的總RNA具有較好的完整性。樣本提取的RNA總量≥3 μg，具備二代測(cè)序的要求。

2.2 差異表達(dá)miRNA的可視化分析

本次測(cè)序共檢測(cè)到1624種miRNA，其中差異表達(dá)明顯miRNA的共44種，其中23種在喉癌組織中顯著下調(diào)，21種在喉癌組織中顯著上調(diào)。miRNA的差異表達(dá)見(jiàn)火山圖1，聚類分析熱圖見(jiàn)圖2，miRNA在喉癌及癌旁的分布情況見(jiàn)維恩圖3。

綠點(diǎn)表示顯著下調(diào)，紅點(diǎn)表示顯著上調(diào)，藍(lán)點(diǎn)表示無(wú)明顯差異

紅框代表高表達(dá)，藍(lán)框代表低表達(dá)，Tumor代表喉癌組，Normol代表癌旁組

差異miRNA分布情況，VPT代表喉癌組，VPN代表癌旁組

2.3 qRT-PCR結(jié)果及驗(yàn)證

在46種差異表達(dá)明顯的miRNA中隨機(jī)抽取1種(miR-106a-5p),其二代測(cè)序結(jié)果顯示在喉癌組織中表達(dá)上調(diào)，見(jiàn)表2。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果，miR-106a-5p在30例喉癌組織中的表達(dá)水平為(5.71±1.65)，癌旁組織中的表達(dá)水平為(2.66±0.87)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與二代測(cè)序結(jié)果一致，見(jiàn)圖4。

圖4 miR-106a-5p在30組喉癌及癌旁組織的表達(dá)水平

表2 癌組織及癌旁組織中miR-106a-5p表達(dá)水平

3 討 論

第二代測(cè)序技術(shù)為分析miRNA的生物學(xué)信息研究提供了新的思路，它可同時(shí)分析miRNA的表達(dá)水平和序列變化[8]。與其他需要使用預(yù)先設(shè)計(jì)的探針的微陣列或qRT-PCR方法不同，第二代測(cè)序技術(shù)可以識(shí)別分析樣本中存在的所有miRNA分子，而不受新的miRNA和新序列亞型[9]的影響。miRNA是一種短鏈非編碼小RNA，通過(guò)與轉(zhuǎn)錄本[10]中的互補(bǔ)序列結(jié)合抑制蛋白編碼基因的表達(dá)。雖然關(guān)于miRNA的所有生物學(xué)功能尚未明確，但已有研究表明，miRNA可以調(diào)控至少一半的人類蛋白編碼基因的表達(dá)，包括致癌基因和抑癌基因[11-12]。因此，應(yīng)用第二代測(cè)序技術(shù)去研究發(fā)掘差異性表達(dá)的miRNA，并為臨床治療提供有價(jià)值的生物靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。

本研究通過(guò)第二代測(cè)序技術(shù)與生物信息學(xué)方法的結(jié)合方法，從3組喉癌及癌旁組織中共篩選出1624種miRNA，其中差異表達(dá)明顯的miRNA共有44種，23種在喉癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)，21種在喉癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)。經(jīng)過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證表明，miR-106a-5p在30組喉癌組織的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，與二代測(cè)序結(jié)果一致。雖然此次測(cè)序成功篩選的miRNA并不多，而且顯著差異性表達(dá)的miRNA占比比較少，但是它們潛在的臨床價(jià)值是非常巨大的。譬如我們經(jīng)過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證并篩選的miR-106a-5p已經(jīng)在相關(guān)腫瘤性疾病中進(jìn)行了大量的研究。研究表明,miR-106a-5p在肺癌[13]、卵巢癌[14]中高度表達(dá)，并促進(jìn)癌癥細(xì)胞的增殖及遷移，然而在腎癌[15]中表達(dá)下調(diào)，并通過(guò)調(diào)控VEGFA抑制癌癥細(xì)胞的增殖及遷移。然而關(guān)于miR-106a-5p與喉癌的相關(guān)性分析尚不明確，有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)去研究。

喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生與發(fā)展是復(fù)雜而多變的病理過(guò)程。而miRNA在機(jī)體的生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡、分化、代謝和腫瘤性疾病的發(fā)生發(fā)展中均展現(xiàn)了強(qiáng)大的調(diào)控能力。因此提高miRNA與喉癌之間的發(fā)病機(jī)制的認(rèn)知尤為重要。本次實(shí)驗(yàn)二代測(cè)序及qRT-PCR驗(yàn)證的樣本相對(duì)較少，且篩選出差異性表達(dá)明顯的miRNA并不多，將來(lái)可以投入更大量的樣本中去篩選、驗(yàn)證有價(jià)值的miRNA。

綜上所述，應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)去篩選疾病相關(guān)miRNA是一條高效率且快捷的途徑，為探索喉癌的分子機(jī)制提供了重要思路，也為臨床尋找新的生物靶點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。