徐明昊，王圓圓，荊雨，孫翠翠，王慶軍

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

胰腺癌是死亡率很高的惡性腫瘤，位列癌癥相關(guān)死因的第4位，以及消化系統(tǒng)癌癥相關(guān)死因的第2位。手術(shù)切除是唯一有可能治愈的手段，但由于患者就診時(shí)多處于疾病相對(duì)進(jìn)展或多發(fā)轉(zhuǎn)移階段，僅15%～20%的患者適合行胰腺切除術(shù)。此外，即使是完全切除后，預(yù)后也很差。切緣陰性(R0)胰十二指腸切除術(shù)后，淋巴結(jié)陰性者的5年生存率約為30%，淋巴結(jié)陽(yáng)性者為10%[1]。因此，尋找胰腺癌相關(guān)特異性基因?qū)τ谝认侔┰缙诤Y查具有重要臨床意義。粘連蛋白(cohesins)是連接兩個(gè)染色體拷貝(姐妹染色體)之間的一種蛋白質(zhì)復(fù)合物，其可以確保姐妹染色單體在細(xì)胞分裂的時(shí)候被均等分配到了子代細(xì)胞中。

早期姐妹染色單體解離蛋白(PDS5)是和粘連蛋白相關(guān)的一種蛋白質(zhì)，可以沿著不同的染色體區(qū)域與粘連蛋白結(jié)合；在脊椎動(dòng)物中有兩種PDS5形式：PDSA和PDSB。研究顯示PDS5A與細(xì)胞周期相關(guān)，可促進(jìn)G2/M期細(xì)胞增殖，機(jī)制可能是通過(guò)與p63的相互作用促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展[2]。PDS5A是一種核蛋白，在細(xì)胞中姊妹染色單體的建立、維持起重要作用。在乳腺癌、腎癌、食管癌、胃癌、肝癌和結(jié)腸癌及惡性膠質(zhì)瘤中觀察到PDS5A表達(dá)水平的改變[3]。但其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的具體機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)應(yīng)用GEPIA分析來(lái)自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和GTEx項(xiàng)目的所有惡性腫瘤患者數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)PDS5A在胰腺癌表達(dá)與患者的預(yù)后具有相關(guān)性。因此我們?cè)诒狙芯糠治銎湓谝认侔┲械谋磉_(dá)及其與分期、預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載基因表達(dá)數(shù)據(jù)

用于篩選患者差異基因的數(shù)據(jù)下載自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的RNA-seq數(shù)據(jù)。項(xiàng)目名稱為“pancreatic adenocarcinoma，PAAD”。用平臺(tái)文件中的探針I(yè)D將下載的資料轉(zhuǎn)化為Gene symbol，得到標(biāo)準(zhǔn)基因名稱的矩陣。

1.2 GEPIA 分析基因表達(dá)及與分期及預(yù)后的關(guān)系

在GEPIA2的搜索框中輸入目標(biāo)基因名稱“PDS5A”，在分析工具欄里選擇“profile”，輸入基因名稱“PDS5A”，分析其在所有腫瘤中的表達(dá)情況。分析工具欄里選擇“BOXBAR”，添加所有腫瘤類型，logFC臨界值設(shè)為1，P值設(shè)為0.05，對(duì)比分析并篩選PDS5A基因在正常及腫瘤組織間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異表達(dá)的腫瘤類型。分析工具欄里選擇“stage BAR”，腫瘤類型為“pancreatic adenocarcinoma，PAAD”，分析PDS5A基因與胰腺癌分期的關(guān)系。分析工具欄里選擇“multiple Survival Plots”，輸入基因名稱“PDS5A”，分組方式選“Quartile”，選擇所有腫瘤。分析PDS5A在所有腫瘤中與生存(OS，DFS)的相關(guān)性。

1.3 篩選差異基因及GO富集

對(duì)下載的基因表達(dá)數(shù)據(jù)以PDS5A表達(dá)的中位值為分界，分為PDS5A低表達(dá)及高表達(dá)組。應(yīng)用limma R語(yǔ)言包篩選差異基因，其中Fdr臨界值設(shè)為0.05，logFC臨界值設(shè)為1，篩選后的差異基因進(jìn)行GO富集。

1.4 材料與試劑

PCNA-1(人胰腺癌細(xì)胞)、BON-1(人胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌瘤細(xì)胞)、HPDE6-C7(胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞)購(gòu)于中科院上海生命科學(xué)研究院。鼠抗人多克隆PDS5A抗體購(gòu)于Abnova公司，鼠抗人單克隆 GAPDH 抗體購(gòu)于北京中杉金橋公司。

1.5 Western blot

取細(xì)胞株行預(yù)處理后加入RIPA裂解液，提取蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。于10%的SDS-PAGE中電泳，電泳結(jié)束后將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫5%脫脂奶粉封閉2 h，用一抗 PDS5A(抗體終濃度均為 1∶500)進(jìn)行4 ℃孵育過(guò)夜。后用以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗(稀釋度 1∶1500)室溫孵育1.5 h，TBST 洗滌后用發(fā)光顯色并拍照。以 GAPDH(稀釋度 1∶1500)作為內(nèi)參對(duì)照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

PDS5A基因及其異構(gòu)體的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系應(yīng)用Kaplan-Meier法計(jì)算，兩組間生存率比較采用Log-rank檢驗(yàn)，P<0.05代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PDSA在不同類型腫瘤中的表達(dá)情況

應(yīng)用 GEPIA分析來(lái)自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和GTEx項(xiàng)目中各種腫瘤的腫瘤組織及正常組織中PDS5A表達(dá)情況。在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中我們觀察PDS5A在腫瘤組織及正常組織中表達(dá)情況，見(jiàn)圖1A。進(jìn)一步可以發(fā)現(xiàn)在膽管癌(cholangiocarcinoma，CHOL)、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(lymphoid neoplasm diffuse large b-cell lymphoma，DLBC)、胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma，PAAD)、胃腺癌(stomach adenocarcinoma，STAD)、胸腺瘤(thymoma，THYM)中PDS5A高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1B。

A：PDS5A在腫瘤組織與正常組織的表達(dá)水平；B：PDS5A在腫瘤組織中高表達(dá)且具有統(tǒng)計(jì)意義的腫瘤，*表示P<0.05

2.2 PDS5A表達(dá)與腫瘤預(yù)后的關(guān)系分析

應(yīng)用 GEPIA2分析來(lái)自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中不同腫瘤的PDS5A表達(dá)情況與生存的相關(guān)性。我們?cè)?50例PAAD數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)PDS5A高表達(dá)與總生存 (overall survival，OS)具有負(fù)相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05，見(jiàn)圖2A。與無(wú)病生存期(disease-free survival，DFS)差異無(wú)相關(guān)性，見(jiàn)圖2B。

A：PDS5A表達(dá)與胰腺癌OS的相關(guān)性；B：PDS5A表達(dá)與胰腺癌DFS的相關(guān)性

2.3 PDS5A與腫瘤分期的相關(guān)性

進(jìn)一步亞組分析我們觀察了PDS5A基因與胰腺癌分期的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)PDS5A與分期無(wú)相關(guān)性，見(jiàn)圖3。

圖3 PDS5A表達(dá)與胰腺癌分期的相關(guān)性

2.4 差異基因的GO富集分析

通過(guò)篩選PDS5A不同表達(dá)組的差異基因，并進(jìn)行GO富集。我們發(fā)現(xiàn)PDS5A相關(guān)差異基因主要富集于消化系統(tǒng)功能相關(guān)的AQP5、SPINK1及上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能相關(guān)的MUC6、TFF2等基因上，見(jiàn)圖4。進(jìn)一步的柱狀圖分析顯示PDS5A基因的表達(dá)與這些基因有相關(guān)性，其高表達(dá)的同時(shí)AQP5、SPINK1、MUC6、TFF2表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖5。

圖4 PDS5A高低表達(dá)組差異基因的GO富集

2.5 PCNA-1(人胰腺癌細(xì)胞)、BON-1(人胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌瘤細(xì)胞)、HPDE6-C7(胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞)中PDS5A表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，PCNA-1細(xì)胞中PDS5A的表達(dá)高于BON-1及HPDE6-C7細(xì)胞，見(jiàn)圖6。

**表示P<0.01；*表示P<0.05

圖6 PDS5A在不同細(xì)胞中的表達(dá)

3 討 論

染色體不穩(wěn)定和非整倍體形成，即染色體的獲得和丟失，是大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞的特征，發(fā)生在腫瘤形成的早期階段[4]。這種改變可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的放松調(diào)節(jié)，抑癌基因的缺失和致癌基因的過(guò)度表達(dá)[5]。PDS5蛋白質(zhì)早熟解離，是一種在姐妹染色單體存在凝聚時(shí)表達(dá)的核蛋白，與粘蛋白復(fù)合物相互作用形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，將姐妹染色單體連接在一起，并通過(guò)有絲分裂使紡錘體在子細(xì)胞之間平均分布[6]。在人類細(xì)胞中，PDS5參與穩(wěn)定復(fù)制的機(jī)制被干擾從而導(dǎo)致DNA出現(xiàn)損傷[7]。因此，PDS5表達(dá)缺陷不僅導(dǎo)致染色體錯(cuò)配和非整倍體出現(xiàn)，而且導(dǎo)致DNA修復(fù)缺陷，從而導(dǎo)致有絲分裂細(xì)胞死亡和癌變。脊椎動(dòng)物中有兩種PDS5蛋白，PDS5A和PDS5B，但其功能機(jī)制尚不十分明確。

研究表明，在乳腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PDS5A可使G1期細(xì)胞數(shù)量增加和caspase-3活化增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。此外，與相應(yīng)的正常組織相比，在乳腺和腎臟腫瘤樣本中觀察到PDS5A mRNA的下調(diào)[8]，而另一項(xiàng)研究報(bào)告了在食管、胃、肝臟和橫結(jié)腸腫瘤中PDS5A mRNA水平的上調(diào)。PDS5A在鼻咽癌細(xì)胞中的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖，但PDS5A siRNA的表達(dá)則減低[2]1-11?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明PDS5A在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能具有極強(qiáng)組織特異性，不同的細(xì)胞和組織類型，可顯示出腫瘤細(xì)胞增殖抑制或過(guò)度增殖作用。因此本研究旨在探討PDS5A與惡性腫瘤的關(guān)系及機(jī)制。我們通過(guò)GEPIA在線分析軟件分析了在各個(gè)惡性腫瘤中PDS5A表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在5種腫瘤組織中高表達(dá)，且與正常組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，我們Western blot的研究顯示PDS5A在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)高于正常胰腺細(xì)胞。進(jìn)一步的預(yù)后分析表明其與胰腺癌預(yù)后指標(biāo)OS具有相關(guān)性，PDS5A高表達(dá)組顯示出較差的OS結(jié)局，但與DFS并未顯示出相關(guān)性。考慮其原因可能是可RO切除的胰腺癌患者相對(duì)體能較好、分期較早、無(wú)轉(zhuǎn)移及血管浸潤(rùn)，因此這部分患者未表現(xiàn)出DFS的差異。同時(shí)有研究顯示，病灶相對(duì)局限的胰腺癌最可能通過(guò)切除治愈，不過(guò)有局限性淋巴結(jié)受累的胰腺癌患者接受完全R0切除后，約有30%也可能長(zhǎng)期生存[1]185-191。

研究表明，ⅠA期、ⅠB期、ⅡA期、ⅡB期和Ⅲ期胰腺癌患者的中位生存期分別為38、24、18、17和14個(gè)月[9]，這說(shuō)明胰腺癌分期越晚，預(yù)后越差。但遺憾的是我們的分析顯示PDS5A的表達(dá)與腫瘤的分期并無(wú)相關(guān)性，考慮可能與獲取的病理組織分期及特點(diǎn)有關(guān)。胰腺癌預(yù)后差，初診時(shí)往往已經(jīng)因患者病灶廣泛、浸潤(rùn)血管、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、體能欠佳失去手術(shù)機(jī)會(huì)，因此納入的可手術(shù)病理標(biāo)本往往分期較早，進(jìn)而導(dǎo)致患者的篩選存在偏倚而無(wú)法觀察到與分期的關(guān)系。

我們進(jìn)一步通過(guò)對(duì)PDS5A高表達(dá)組與低表達(dá)組差異基因的GO富集發(fā)現(xiàn)，AQP5、SPINK1、MUC6、TFF2等相關(guān)差異基因主要富集在消化功能和上皮結(jié)構(gòu)相關(guān)功能基因類別上，同時(shí)與PDS5A的表達(dá)負(fù)相關(guān)。腫瘤所依賴的各種代謝都需要水分子的參與，而水通道蛋白可以快速特異的轉(zhuǎn)運(yùn)水分子。AQP5作為水通道家族成員之一，在維持腫瘤細(xì)胞滲透壓穩(wěn)定，腫瘤細(xì)胞遷移、EMT，腫瘤新生血管形成過(guò)程中起到重要作用[10]。SPINK1又被稱為胰腺分泌性胰酶抑制因子，由 56 個(gè)氨基酸殘基組成，可抑制胰蛋白酶原活性，拮抗胰腺的“自身消化”。其與胰蛋白酶的比例參與維持胰腺內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。SPINK1 基因突變與慢性胰腺炎的發(fā)生密切相關(guān)，而后者則是胰腺癌發(fā)生的危險(xiǎn)因子。研究證實(shí)，SPINK1 作為腫瘤抑癌基因參與負(fù)向調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[11]。MUC 6(黏蛋白 6)作為黏蛋白家族成員之一，由上皮細(xì)胞分泌，參與保護(hù)黏膜上皮、調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附等功能，當(dāng)上皮細(xì)胞受損或癌變時(shí)異常表達(dá)。有研究顯示，粘蛋白相關(guān)疫苗可通過(guò)激活患者的免疫系統(tǒng)起到抗腫瘤作用[12]。另有研究報(bào)道，通過(guò)調(diào)節(jié)黏蛋白的表達(dá)，可明顯抑制腫瘤進(jìn)展[13]。FFT2作為三葉因子家族成員之一，具有及保護(hù)及修復(fù)黏膜、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞調(diào)往等功能[14]，所以被認(rèn)為是抑癌因子。這與我們的發(fā)現(xiàn)基本一致，PDS5A高表達(dá)與AQP5、SPINK1、MUC6、TFF2等抑癌基因低表達(dá)相關(guān)，故認(rèn)為可導(dǎo)致胰腺癌預(yù)后不良。

總結(jié)，染色體不穩(wěn)定和非整倍體形成，是大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞的重要特征，發(fā)生在腫瘤發(fā)展的早期階段。但其在腫瘤中的發(fā)生、發(fā)展中的具體作用尚不十分清楚。我們的分析表明PDS5A在胰腺癌中的表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)，其高表達(dá)提示預(yù)后不良。進(jìn)一步富集分析表明其與消化功能及上皮結(jié)構(gòu)相關(guān)基因呈負(fù)相關(guān)。我們提出假設(shè)，其在胰腺癌中的高表達(dá)也可能通過(guò)這兩方面的功能異常導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移能力及惡性程度增強(qiáng)，進(jìn)而使患者預(yù)后較差。本研究目前主要集中于現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)臨床樣本資料的分析并進(jìn)行了初步的Western blot分析，進(jìn)一步的研究將在免疫組化及更進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相關(guān)機(jī)制。