高小寧 孫輝 李婷 齊永文

摘要：以廣東省甘蔗褐斑病菌（Cercospora longipes）CL12分離株為對象，研究了溫度、pH值、培養(yǎng)基種類、不同碳源和氮源對菌株菌絲生長和分生孢子萌發(fā)的影響，為進(jìn)一步研究甘蔗尾孢引起的褐斑病的發(fā)生規(guī)律和防治藥劑篩選奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明，CL12分離株的菌絲在供試的10種培養(yǎng)基上都可以生長，但表現(xiàn)出較大差異;其中PDA和PSA培養(yǎng)基有利于菌絲生長，而MS和N6培養(yǎng)基不適合該菌生長。以Czapek培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)，果糖作為碳源、牛肉膏和酵母粉作為氮源最適宜病菌的菌絲生長。菌絲生長的溫度范圍為5～35 ℃，最適溫度為25 ℃;菌絲生長最適pH值為5，在pH值為4.0～10.0均可生長;分生孢子萌發(fā)的溫度范圍為15～35 ℃，pH值為4.0～10.0，最適萌發(fā)條件為 25 ℃，pH值為6.0。

關(guān)鍵詞：甘蔗;甘蔗尾孢菌;培養(yǎng)特性;孢子萌發(fā);碳源;氮源

中圖分類號(hào)：S435.661 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）07-0115-04

收稿日期：2020-07-15

基金項(xiàng)目：廣東省科學(xué)院研究所績效考核引導(dǎo)專項(xiàng)（編號(hào)：2020GDASYL-20200302005）;廣東省甘蔗劍麻產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（編號(hào)：2019KJ104-05）;廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2019B020238001）

作者簡介：高小寧（1978—），女，陜西岐山人，博士，副教授，從事甘蔗病害研究。Tel：（020）34397561;E-mail：gxn336@126.com。

通信作者：齊永文，博士，研究員，從事甘蔗遺傳育種研究。Tel：（020）84178036;E-mail：yongwen2001@163.com。

甘蔗（Saccharum spp.）是我國最重要的糖料作物，而病害是影響甘蔗生產(chǎn)的重要因素。目前世界上已經(jīng)報(bào)道的甘蔗病害達(dá)130種，我國記錄的甘蔗侵染性病害已超過50種[1]，其中由真菌引起的褐銹病（brown rust）、梢腐病（pokkah boeng）、褐條病（brown stripe）、褐斑?。╞rown spot）等葉部病害在我國蔗區(qū)發(fā)生普遍，對甘蔗生產(chǎn)造成了嚴(yán)重威脅。由甘蔗尾孢（Cercospora longipes E. E. Butler）引起的甘蔗褐斑病[2]于1906年首次在印度發(fā)現(xiàn)，目前在世界甘蔗產(chǎn)區(qū)廣泛分布。褐斑病主要危害甘蔗葉片，發(fā)病初期受害葉片呈黃色小斑點(diǎn)，隨后擴(kuò)大形成具有黃色暈圈的長梭形紅褐色病斑，田間濕度較大時(shí)，葉片背面產(chǎn)生灰色霉層，嚴(yán)重發(fā)病可導(dǎo)致葉片提前枯死，呈現(xiàn)“火燒”狀，從而給甘蔗生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失[3]。褐斑病作為甘蔗的主要葉部病害之一，前期研究人員對該病害在我國不同蔗區(qū)的分布和危害情況進(jìn)行了大量的調(diào)查分析，發(fā)現(xiàn)該病害在我國蔗區(qū)廣西、云南、廣東、貴州、海南等地廣泛分布，常年危害，對甘蔗正常生長產(chǎn)生了一定的影響[4-8]，并評(píng)價(jià)了幾種化學(xué)藥劑對該病害的防治效果，發(fā)現(xiàn)苯甲·嘧菌酯對甘蔗褐斑病表現(xiàn)出良好的防效[5]。然而，已有研究中缺少對其病原菌生物學(xué)特性的相關(guān)報(bào)道。

了解病菌的生物學(xué)特性是深入理解病害發(fā)生規(guī)律的基礎(chǔ)，進(jìn)而為病害的有效防控提供理論依據(jù)。在前期研究中，筆者從廣東省翁源縣采集甘蔗褐斑病病樣并對其病菌進(jìn)行分離鑒定和致病性測定，獲得1株甘蔗尾孢（C. longipes）分離株CL12。因此，本研究以分離株CL12為對象，研究溫度、pH值以及營養(yǎng)條件對其菌絲生長和分生孢子萌發(fā)的影響，以期為進(jìn)一步研究病害發(fā)生流行規(guī)律，制定防治技術(shù)方案奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：甘蔗尾孢（C. longipes）CL12分離株，按常規(guī)方法在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）平板上繁殖、保存?zhèn)溆?。菌株CL12生物學(xué)特性測定試驗(yàn)于2019年在廣東省科學(xué)院生物工程研究所進(jìn)行。

供試培養(yǎng)基及其配方：PDA（200 g/L馬鈴薯、20 g/L 葡萄糖、15 g/L瓊脂粉）、PSA（200 g/L馬鈴薯、20 g/L蔗糖、15 g/L瓊脂粉）、MEA（30 g/L麥芽浸粉、3.0 g/L大豆蛋白胨、15 g/L瓊脂粉）、CAM（2.0 g/L玉米浸粉、15 g/L瓊脂粉）、Czapek（3 g/L NaNO3、1 g/L KH2PO4、0.5 g/L MgSO4·7H2O、0.5 g/L KCl、0.01 g/L FeSO4、30 g/L蔗糖、15 g/L瓊脂粉）、LBA（10 g/L NaCl、10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母粉、15 g/L瓊脂粉）、YPD（20 g/L葡萄糖、20 g/L 蛋白胨、10 g/L酵母粉、15 g/L瓊脂粉）、N6[2 830 mg/L KNO3、463 mg/L （NH4）2SO4、166 mg/L CaCl2·2H2O、185 mg/L MgSO4·7H2O、400 mg/L KH2PO4、27.8 mg/L FeSO4·7H2O、4.4 mg/L MnSO4·4H2O、1.6 mg/L ZnSO4·7H2O、0.8 mg/L H2BO3、1.6 mg/L KI、2 mg/L甘氨酸、0.5 mg/L煙酸]、MS[1 900 mg/L KNO3、1 650 mg/L （NH4）2SO4、170 mg/L KH2PO4、370 mg/L MgSO4·7H2O、440 mg/L CaCl2·2H2O、0.83 mg/L KI、6.2 mg/L H2BO3、22.3 mg/L MnSO4·4H2O、8.6 mg/L ZnSO4·7H2O、0.25 mg/L Na2MoO4·2H2O、0.25 mg/L CuSO4·5H2O、0.025 mg/L CoCl2·6H2O、37.25 mg/L Na2EDTA、27.85 mg/L FeSO4·7H2O、100 mg/L肌醇、2 mg/L甘氨酸、0.5 mg/L 煙酸、0.5 mg/L鹽酸吡哆醇、0.1 mg/L鹽酸硫胺素、30 g/L蔗糖、15 g/L瓊脂粉]、WA（15 g/L瓊脂）。上述培養(yǎng)中的N6和MS購自Sigma公司，其他培養(yǎng)基均按照配方進(jìn)行配制;配制好的培養(yǎng)基于滅菌鍋中121 ℃濕熱高壓滅菌20 min后備用。

1.2 營養(yǎng)條件對菌絲生長的影響

1.2.1 不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響 在培養(yǎng) 20 d 的分離株CL12菌落邊緣，用滅菌打孔器取直徑5 mm的菌餅，分別轉(zhuǎn)接于PDA、PSA、MEA、CAM、Czapek、LBA、YPD、N6、MS和WA等10種不同培養(yǎng)基制成的平板中央。將培養(yǎng)皿置于25 ℃培養(yǎng)箱中恒溫避光培養(yǎng)，每處理3次重復(fù)。采用“十”字交叉法每7 d測量菌落直徑，觀察并記錄菌落形態(tài)[9]。

1.2.2 不同碳源對菌絲生長的影響 以Czapek培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)，分別以等量的葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、可溶性淀粉、麥芽糖、山梨醇和肌醇替代其中的蔗糖，制成不同碳源培養(yǎng)基。按照“121”節(jié)所描述的方法進(jìn)行病菌的接種、培養(yǎng)、觀察菌落生長情況并測量菌落直徑。每處理重復(fù)3次。

1.2.3 不同氮源對菌絲生長的影響 以Czapek培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)，分別以等量的牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、甘氨酸、NH4Cl、NH4NO3和Ca（NO3）2替代其中NaNO3，制成不同氮源培養(yǎng)基。按照“1.2.1”節(jié)所描述的方法進(jìn)行病菌的接種、培養(yǎng)、觀察菌落生長情況并測量菌落直徑。每處理重復(fù)3次。

1.3 培養(yǎng)條件對菌絲生長的影響

1.3.1 溫度對菌絲生長的影響 以PDA作為培養(yǎng)基，將接菌的培養(yǎng)皿分別置于5、10、15、20、25、30、35、40 ℃下培養(yǎng)。按照“1.2.1”節(jié)所描述的方法進(jìn)行病菌的接種、培養(yǎng)、觀察菌落生長情況并測量菌落直徑。每處理重復(fù)3次。

1.3.2 pH值對菌絲生長的影響 用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH，將PDA培養(yǎng)基的pH值調(diào)制成4、5、6、7、8、9、10。按照“1.2.1”節(jié)所描述的方法進(jìn)行病菌的接種、培養(yǎng)、觀察菌落生長情況并測量菌落直徑。每處理重復(fù)3次。

1.4 培養(yǎng)條件對分生孢子萌發(fā)的影響

1.4.1 溫度對分生孢子萌發(fā)的影響 用玉米葉粉碳酸鈣瓊脂培養(yǎng)基（MLPCA）培養(yǎng)分生孢子，用無菌水配制為每視野（10×40）20～30個(gè)分生孢子的懸浮液，采用凹孔載玻片法進(jìn)行孢子萌發(fā)試驗(yàn)[9]。將裝有分生孢子懸浮液的凹玻片分別置于5、10、15、20、25、30、35、40 ℃下，于3、6 h鏡檢分生孢子萌發(fā)情況，計(jì)算萌發(fā)率。每處理重復(fù)3次。

1.4.2 pH值對分生孢子萌發(fā)的影響 用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH，將無菌水配制成pH值為4、5、6、7、8、9、10共7個(gè)梯度的溶液。按照“1.4.1”節(jié)的方法進(jìn)行分生孢子萌發(fā)試驗(yàn)。每處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 營養(yǎng)條件對甘蔗尾孢CL12分離株菌絲生長的影響

2.1.1 不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響 由表1可知，甘蔗尾孢菌在供試的10種培養(yǎng)基上均可生長，但生長情況差異較大。從菌落形態(tài)和生長速度來看，PDA、PSA、YPD較適宜于甘蔗尾孢的菌絲生長，其次為CAM和MEA;在WA上菌絲極為稀疏，而MS和N6培養(yǎng)基不適合甘蔗尾孢的菌絲生長。

2.1.2 不同碳源對菌絲生長的影響 由表2可知，分離株CL12能夠利用多種單糖、多糖和可溶性淀粉作為碳源，不同碳源對其菌絲生長有一定影響。在供試的8種碳源中， 果糖是甘蔗尾孢菌的最佳碳源，葡萄糖、麥芽糖和肌醇次之，其對可溶性淀粉的利用較差。

2.1.3 不同氮源對甘蔗尾孢菌菌絲生長的影響 甘蔗尾孢菌菌絲在不同氮源培養(yǎng)基中的生長情況（表3）表明，分離株CL12能夠不同程度地利用無機(jī)氮源和有氮源，但不同氮源對病菌菌絲生長影響顯著。供試菌株最適氮源為牛肉膏和酵母粉，其次為蛋白胨，對NH4Cl和NH4NO3的利用較差。

2.2 培養(yǎng)條件對甘蔗尾孢CL12分離株菌絲生長的影響

2.2.1 溫度對菌絲生長的影響 不同溫度對甘蔗尾孢CL12分離株菌絲生長的測試結(jié)果（圖1）表明，該分離株在5～35 ℃溫度范圍內(nèi)均可生長，高于 35 ℃ 不能生長，最適生長溫度為25 ℃。

2.2.2 pH值對菌絲生長的影響 分離株CL12在4.0～10的7個(gè)pH值梯度條件下均可生長，對pH值表現(xiàn)出較廣的適應(yīng)范圍，其中在pH值為5的條件下菌落直徑最大，表明該分離株比較適合偏酸的生長環(huán)境（圖2）。

2.3 培養(yǎng)條件對甘蔗尾孢CL12分離株分生孢子萌發(fā)的影響

2.3.1 溫度對分生孢子萌發(fā)的影響 甘蔗尾孢CL12分離株的分生孢子萌發(fā)率在不同溫度下存在較大差異（圖3）。該菌株分生孢子在15～35 ℃溫度范圍內(nèi)均可萌發(fā)，最適萌發(fā)溫度為25 ℃，高于 35 ℃ 或低于10 ℃均不能萌發(fā)。

2.3.2 pH值對菌絲生長的影響 甘蔗尾孢分離株CL12的分生孢子在pH值4～10的7個(gè)梯度條件下均可正常萌發(fā)（圖4），表現(xiàn)出較廣pH值適應(yīng)性;其中pH值在5～9的范圍內(nèi)，分生孢子萌發(fā)率均高于85%。

3 結(jié)論與討論

尾孢菌類真菌是無性型真菌絲孢菌綱，絲孢目，由Fresenius在1863年建立[10]。尾孢菌屬（Cercospora Fresen.）是重要的植物病原菌，可危害植物的不同部位，形成明顯的壞死斑[11]。該類真菌能夠侵染多種農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物，致使受害植物出現(xiàn)葉片枯黃，提前落葉、落花、落果，嚴(yán)重影響作物生長，造成一定的經(jīng)濟(jì)損失[12]。由玉蜀黍尾孢菌（C. zeae-maydis Tehon et Daniels）引起的玉米灰斑病在我國廣泛分布，已經(jīng)成為玉米生產(chǎn)種的重要問題[13];甜菜尾孢菌（C. beticola）引起的褐斑病是甜菜生產(chǎn)中的重要葉部病害，在全世界嚴(yán)重發(fā)生[14]。由甘蔗尾孢菌（C. longipes）引起的甘蔗褐斑病在我國蔗區(qū)均有分布，是經(jīng)常發(fā)生且造成危害的主要葉部病害之一。

然而，尾孢菌在人工培養(yǎng)基上生長緩慢，導(dǎo)致對甘蔗褐斑病的研究僅停留在對病害的田間調(diào)查，缺少對其病菌的生物學(xué)特性的研究，從而限制了對該病害侵染過程和發(fā)病規(guī)律的認(rèn)識(shí)。因此，本試驗(yàn)通過對甘蔗尾孢CL12分離株的培養(yǎng)形狀、溫度、pH值的適應(yīng)性以及不同營養(yǎng)利用情況的研究，明確其基本生物學(xué)特性。研究結(jié)果表明，CL12分離株對溫度有較廣的適應(yīng)性，5～35 ℃均可生長，但其20～25 ℃ 的最適生長溫度相同，這與甘蔗生長及其褐斑病發(fā)生區(qū)域的氣候條件相一致。但與劉可杰等報(bào)道的玉米尾孢病菌在10～30 ℃范圍內(nèi)均可生長[15]，略有不同。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)該病菌對不同營養(yǎng)的利用差異顯著。CL12分離株在PDA、PSA、YPD等培養(yǎng)基上生長良好，菌落生長速度較快，菌絲致密;在WA培養(yǎng)基上雖然菌落擴(kuò)展速度最快，但菌絲非常稀疏，其生長特性與已經(jīng)報(bào)道的玉米灰斑病菌基本一致[15]。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)果糖、牛肉膏和酵母粉是甘蔗尾孢CL2分離株最適合的碳源、氮源;而對于玉米尾孢病菌，可溶性淀粉和麥芽糖是其最佳碳源，說明不同的尾孢菌的營養(yǎng)利用情況有較大差異。本試驗(yàn)通過對甘蔗褐斑病菌生物學(xué)特性的研究，基本明確了甘蔗尾孢菌適宜的培養(yǎng)條件和營養(yǎng)條件。然而，由于本試驗(yàn)只針對從廣東省分離獲得的1株甘蔗尾孢菌的培養(yǎng)特性進(jìn)行分析，那么病菌群體的不同菌株間、不同地區(qū)的菌株間是否存在差異，還須進(jìn)一步研究。

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