王 婷,王云飛,欒 鋒,趙春燕

(1.煙臺(tái)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,山東 煙臺(tái) 264005;2.蘭州大學(xué)藥學(xué)院,甘肅 蘭州 730000)

植物雌激素(Phytoestrogen,PE)是一類存在于植物中,能結(jié)合并激活哺乳動(dòng)物或人體內(nèi)雌激素受體(Estrogen Receptor,ER)從而發(fā)揮雌激素樣和抗雌激素雙重作用的植物成分。它們分為四大類:木脂素類、異黃酮類、香豆素類以及二苯乙烯類[1]。其中,木脂素類主要是通過P-羥基苯乙烯單體氧化耦合產(chǎn)生的一類小分子量次生代謝產(chǎn)物,其主要以游離狀態(tài)存在于如夾竹桃科、爵床科、馬兜鈴科等植物中[2],其廣泛分布于植物的根、根狀莖、莖、葉、花、果實(shí)、種子以及木質(zhì)部和樹脂等部位[3]。根據(jù)木脂素的來源[4]可以將其分為植物木脂素和動(dòng)物木脂素。植物木脂素中含量最多的兩種木脂素是開環(huán)異落葉松脂酚(secoisolarlciresinol,SECO)和羅漢松脂酚(matairesinol,MAT)。動(dòng)物木脂素是植物木脂素在哺乳動(dòng)物的腸道菌群[5]作用下產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物,它們分布于動(dòng)物的血清、血漿、尿液和糞便中,主要含腸二醇(enteroldiol,END)和腸內(nèi)脂(enteroctone,ENL)。

不論是植物還是動(dòng)物木脂素的結(jié)構(gòu)都與雌激素(如雌二醇)的結(jié)構(gòu)相似,它們對(duì)預(yù)防及治療與雌激素有關(guān)的疾病如骨組織疏松癥、心血管疾病、前列腺疾病以及冠心病等[6-9]有重要作用。據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研,針對(duì)木脂素類植物雌激素與雌激素受體之間起作用的結(jié)合親和力研究未見報(bào)道,因此,本課題選擇分子動(dòng)力學(xué)模擬方法探究?jī)煞N常見的植物木脂素(羅漢松脂酚和開環(huán)異落葉松脂酚)和兩種動(dòng)物木脂素(腸內(nèi)脂和腸二醇)分別與雌激素受體之間的結(jié)合親和力以及產(chǎn)生的相互作用,以期為研究植物雌激素的類激素作用提供幫助。配體結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 受體蛋白與配體的準(zhǔn)備

雌激素受體ERα(PDB ID∶1GWR)和ERβ(PDB ID∶3OLS)的晶體結(jié)構(gòu)是從RCSB Protein Data Bank[10]中獲得的,并從該結(jié)構(gòu)中得到ERα和ERβ的配體結(jié)合域。受體蛋白的準(zhǔn)備是在Schrodinger 2015-2軟件中的Protein Preparation Wizard模塊[11]中,用OPLS-2005力場(chǎng)[12]對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)處理所得。圖1中四種木脂素類植物雌激素作為小分子配體,其初始結(jié)構(gòu)從Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)[13]中得到。配體的準(zhǔn)備過程是在Schrodinger 2015-2軟件的LigPrep模塊中[14],對(duì)配體進(jìn)行能量?jī)?yōu)化處理。無論是蛋白還是配體的初始結(jié)構(gòu)都將被用于后續(xù)的分子對(duì)接過程中。

圖1 配體結(jié)構(gòu)式

1.2 分子對(duì)接

配體與蛋白的對(duì)接過程如下:首先,以配體為中心,與周圍氨基酸殘基形成一個(gè)立體空間;其次,將準(zhǔn)備好的配體與受體蛋白進(jìn)行對(duì)接,并對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行打分評(píng)估;最后,將對(duì)接產(chǎn)生的蛋白-配體復(fù)合物以PDB的格式輸出,用于下一步的分子動(dòng)力學(xué)模擬過程。該分子對(duì)接過程采用Schrodinger 2015-2軟件中的Glide6.7對(duì)接程序[15-16]完成。

1.3 分子動(dòng)力學(xué)模擬過程

分子動(dòng)力學(xué)模擬過程采用軟件Amber14[17]進(jìn)行。受體蛋白和配體的分子參數(shù)分別采用FF03立場(chǎng)和GAFF立場(chǎng)[18-19]。復(fù)合物需要進(jìn)行加氫處理,并且在體系周圍加上1 nm的TIP3P型的立方體水盒子進(jìn)行溶劑化;分別在ERα體系添加5個(gè)鈉離子,ERβ體系添加2個(gè)鈉離子,來中和負(fù)電荷使體系呈電中性。其中參數(shù)截?cái)嗑嚯x[20]設(shè)為1 nm,積分步程設(shè)為2 fs。

分子動(dòng)力學(xué)模擬過程:首先對(duì)體系進(jìn)行溶劑能量最小化、約束抗衡離子能量最小化以及無限制整體能量最小化,每次能量最小化都先進(jìn)行3000步的最陡下降法優(yōu)化,然后再進(jìn)行2000步的共軛梯度法優(yōu)化;其次運(yùn)行升溫動(dòng)力學(xué)模擬,在50 ps內(nèi)將體系溫度從0 K升至300 K;最后在300 K及恒壓的NPT系統(tǒng)中進(jìn)行100 ns的平衡分子動(dòng)力學(xué)模擬。

1.4 結(jié)合自由能的計(jì)算及分解

結(jié)合自由能的計(jì)算是使用Amber14軟件從MD模擬后的復(fù)合物的動(dòng)力學(xué)軌跡的最后10 ns中按固定間隔提取出1000個(gè)瞬時(shí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行計(jì)算的。其計(jì)算公式如下:

ΔGbind=ΔGcomp-ΔGpro-ΔGlig=

ΔGMM+ΔGsol-TΔS,

ΔGMM=ΔGint+ΔGele+ΔGvdw,

ΔGsol=ΔGpol+ΔGnopol。

其中,ΔGbind是結(jié)合自由能,由復(fù)合物(ΔGcomp)、受體蛋白(ΔGpro)和配體(ΔGlig)的能量組成。ΔGMM是由內(nèi)能(ΔGint)、靜電相互作用能(ΔGele)和范德華能(ΔGvdw)組成的氣相結(jié)合能,其中由于模擬中使用單軌跡方案,配體與受體結(jié)合的構(gòu)象重組能部分被忽略,即ΔGint=0,ΔGsol是由極性(ΔGpol)和非極性(ΔGnopol)溶劑化能組成的溶劑化自由能。由于熵變的計(jì)算過程復(fù)雜,在本研究中忽略熵變對(duì)結(jié)合自由能的影響。

結(jié)合自由能分解是應(yīng)用Amber14軟件中的MM/GBSA自由能分解模塊進(jìn)行的[21]。該過程主要是計(jì)算每個(gè)氨基酸殘基在配體與受體結(jié)合過程中對(duì)總結(jié)合自由能的貢獻(xiàn),并通過對(duì)自由能的分解來考察如范德華能、靜電相互作用能以及溶劑化能等各部分能量對(duì)結(jié)合自由能的貢獻(xiàn)大小。

2 結(jié)果和討論

2.1 動(dòng)力學(xué)軌跡分析

針對(duì)小分子配體與受體蛋白對(duì)接后形成的復(fù)合物進(jìn)行了100 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬,并計(jì)算了各體系的均方根偏差(Root Mean Square Deviation, RMSD),結(jié)果如圖2。圖2中所有體系在30 ns的模擬之后RMSD值基本穩(wěn)定(ERα體系RMSD=0.11～0.22 nm;ERβ體系RMSD=0.14～0.20 nm)。所有體系的RMSD波動(dòng)值均在0.30 nm以下,處于合理范圍內(nèi),這說明所有體系經(jīng)過模擬后均達(dá)到平衡,可以進(jìn)一步分析模擬結(jié)果。

圖2 ERα和ERβ體系中復(fù)合物在100 ns模擬過程中的RMSD值

針對(duì)體系中各個(gè)配體在模擬過程中的狀態(tài)變化,分別計(jì)算了各體系中配體的RMSD值,結(jié)果如圖3。圖3中所有配體的RMSD值均在0.25 nm以下,處于平衡狀態(tài),說明配體在復(fù)合物形成過程中起到一定的穩(wěn)定作用。

圖3 ERα和ERβ體系中配體在100 ns模擬過程中的RMSD值

接著計(jì)算了復(fù)合物中每個(gè)氨基酸的均方根波動(dòng)值(Root Mean Square Fluctuation, RMSF),以分析各個(gè)體系中受體蛋白的構(gòu)象變化,如圖4所示。圖中ERα及ERβ兩個(gè)體系中的RMSF曲線波動(dòng)趨勢(shì)基本相似,即氨基酸在結(jié)合過程中的波動(dòng)相似,說明同一體系中的復(fù)合物的結(jié)合過程相似。ERα體系中的復(fù)合物在氨基酸PRO19、GLU41、LEU75、PRO94、ILE139、ASP172、HIE212和LEU229的周圍均有相似的波動(dòng)。這些氨基酸的RMSF值較小,說明其波動(dòng)較小,對(duì)復(fù)合物的穩(wěn)定起到一定作用。在ERβ體系中也有相同的體現(xiàn),即復(fù)合物在氨基酸PRO15、LEU36、LEU77、PHE94、PHE115、ILE142、LEU158和HIE203的周圍波動(dòng)較小。

圖4 ERα和ERβ體系中復(fù)合物在100 ns模擬過程中的RMSF值

2.2 氫鍵相互作用分析

針對(duì)對(duì)接后復(fù)合物的構(gòu)象進(jìn)行氫鍵相互作用分析,四種木脂素類植物雌激素與ERα及ERβ之間產(chǎn)生氫鍵作用如圖5。氫鍵相互作用是穩(wěn)定配體與受體結(jié)合的主要力量之一,就ERα與ERβ兩個(gè)體系而言,ERβ體系中產(chǎn)生的氫鍵作用大于ERα體系(ERβ體系中氫鍵個(gè)數(shù)為2、3、3、2,ERα體系中為3、2、2、1),表明木脂素類植物雌激素對(duì)ERβ的結(jié)合親和力強(qiáng)于對(duì)ERα的。此外,形成的氫鍵位于配體兩端的結(jié)構(gòu)更有利于復(fù)合物的穩(wěn)定,因此,植物木脂素(羅漢松脂酚和開環(huán)異落葉松脂酚)對(duì)ERα與ERβ的結(jié)合親和力都強(qiáng)于兩種動(dòng)物木脂素(腸內(nèi)脂和腸二醇)。

圖5 配體與受體蛋白之間的氫鍵相互作用

2.3 疏水相互作用分析

針對(duì)復(fù)合物在模擬過程中最后1 ns的軌跡構(gòu)象進(jìn)行疏水相互作用分析,結(jié)果如圖6。圖中顯示結(jié)合口袋處多為疏水性氨基酸,故產(chǎn)生的相互作用為疏水相互作用,且根據(jù)圖中結(jié)合空腔的左側(cè)和底部的疏水勢(shì)明顯強(qiáng)于其他位置,說明疏水相互作用對(duì)復(fù)合物的穩(wěn)定起重要作用。

圖6 復(fù)合物的疏水相互作用(顏色從紅色變?yōu)樗{(lán)色表示疏水勢(shì)降低)

2.4 結(jié)合自由能分析

為深入地研究四種配體與雌激素受體之間親和力,用Amber14中的MM/PBSA分別計(jì)算了四種木脂素類植物雌激素與ERα及ERβ之間經(jīng)過100 ns的MD模擬之后所形成的兩個(gè)體系的結(jié)合自由能,結(jié)果列于表1和2。從表中數(shù)據(jù)可知,結(jié)合自由能主要是由范德華能、靜電能、溶劑化能等幾種能量構(gòu)成。其中,范德華能在幾種相互作用能的貢獻(xiàn)中占主要部分,且其和靜電能、非極性溶劑化作用能的數(shù)值均為負(fù)值,說明其對(duì)配體-蛋白的結(jié)合起促進(jìn)作用。相反的是極性溶劑化作用能對(duì)結(jié)合自由能貢獻(xiàn)為正值,這說明其不利于配體與受體蛋白的結(jié)合。

表1 ERα體系中復(fù)合物的結(jié)合自由能

表2 ERβ體系中復(fù)合物的結(jié)合自由能

此外,根據(jù)表中數(shù)據(jù),ERβ體系中四種復(fù)合物的結(jié)合自由能數(shù)值均小于ERα體系中復(fù)合物的自由能數(shù)值,結(jié)合自由能數(shù)值越低,形成的復(fù)合物越穩(wěn)定,可見ERβ體系的復(fù)合物較ERα體系穩(wěn)定。復(fù)合物ERα-羅漢松脂酚、ERβ-羅漢松脂酚、ERα-開環(huán)異落葉松脂酚和ERβ-開環(huán)異落葉松脂酚的結(jié)合自由能數(shù)值低于ERα-腸內(nèi)脂、ERβ-腸內(nèi)脂、ERα-腸二醇和ERβ-腸二醇的自由能。結(jié)合上述氫鍵相互作用的分析結(jié)果,說明羅漢松脂酚和開環(huán)異落葉松樹脂酚對(duì)ERα和ERβ的結(jié)合親和力強(qiáng)于腸內(nèi)酯和腸二醇。

2.5 結(jié)合自由能的分解

應(yīng)用Amber14中的自由能分解模塊進(jìn)行分解來分析各氨基酸對(duì)總自由能的貢獻(xiàn),結(jié)果如圖7。圖7中標(biāo)注的氨基酸是對(duì)結(jié)合自由能貢獻(xiàn)較大(超過±4.184 kJ/mol)的關(guān)鍵氨基酸。關(guān)鍵氨基酸位于配體與受體形成的結(jié)合空腔中,關(guān)鍵氨基酸的數(shù)目越多,配體與受體之間的相互作用越強(qiáng),可據(jù)此判斷關(guān)鍵氨基酸在結(jié)合過程中起到的穩(wěn)定作用大小。復(fù)合物ERα-羅漢松脂酚、ERα-開環(huán)異落葉松脂酚、ERβ-羅漢松脂酚和ERβ-開環(huán)異落葉松脂酚的關(guān)鍵氨基酸的數(shù)目(依次為13、13、12、12)多于復(fù)合物ERα-腸內(nèi)脂、ERα-腸二醇、ERβ-腸內(nèi)脂和ERβ-腸二醇中關(guān)鍵氨基酸的數(shù)目(依次為9、8、11、10)。因此,前四種復(fù)合物比后四種復(fù)合物更穩(wěn)定。

圖7 氨基酸對(duì)結(jié)合自由能的貢獻(xiàn)

對(duì)關(guān)鍵氨基酸進(jìn)一步能量分解的結(jié)果見圖8,在此過程中將自由能分解為極性部分(圖中條紋部分)和非極性部分(圖中黑色部分)。其中LEU38、ALA42、LEU79、MET80、LEU83、PHE96和LEU214等非極性氨基酸對(duì)結(jié)合自由能的貢獻(xiàn)大于極性氨基酸如GLU45、ARG86等的貢獻(xiàn)。并且非極性部分主要是范德華能貢獻(xiàn),能量為負(fù)值,進(jìn)一步證實(shí)疏水相互作用是配體與受體之間結(jié)合產(chǎn)生的主要相互作用。然而極性部分中的極性溶劑化能的貢獻(xiàn)值為正值,導(dǎo)致極性部分對(duì)總結(jié)合自由能的貢獻(xiàn)減小,發(fā)揮的作用減弱。因此,非極性作用更有利于復(fù)合物的形成。

圖8 關(guān)鍵氨基酸的能量分析

3 結(jié) 論

本文用分子動(dòng)力學(xué)方法研究了四種木脂素類植物雌激素與ERα及ERβ的結(jié)合親和力。氫鍵、疏水相互作用分析以及結(jié)合自由能的分析結(jié)果表明，四種香豆素類植物雌激素對(duì)ERβ的結(jié)合親和力均高于對(duì)ERα的，且植物木脂素(羅漢松脂酚和開環(huán)異落葉松脂酚)對(duì)兩種ER受體的結(jié)合親和力均高于動(dòng)物木脂素(腸內(nèi)脂和腸二醇)對(duì)ER的結(jié)合親和力。自由能分解結(jié)果說明非極性相互作用更有利于配體與受體的結(jié)合。