王曉慧,王慧云,譚文娟,趙風蘭,杜廣營,孟慶國

(1.煙臺大學新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心、分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室(煙臺大學),山東 煙臺 264005;2.濟寧醫(yī)學院藥學院,山東 日照 276826)

某些含氮雜環(huán)化合物的結(jié)構(gòu)與嘌呤、嘧啶等堿基的結(jié)構(gòu)類似,具有較好的生物體內(nèi)環(huán)境相容性,在新藥研發(fā)方面有廣泛的應(yīng)用前景。苯并呋咱及其N-氧化物是有機化學中合成雜環(huán)的重要中間體,具有抗菌、抗寄生蟲、舒張血管、抗腫瘤等廣泛生物活性[1-2],其抗腫瘤機制可能與抑制腫瘤細胞核苷的磷酸化,限制核酸和蛋白質(zhì)的合成,使DNA斷裂有關(guān)[3]。且該類化合物是NO供體,在體內(nèi)經(jīng)巰基類化合物的作用可以緩慢釋放氮氧化物,從而抑制腫瘤細胞生長和逆轉(zhuǎn)腫瘤的耐藥性[4-6]。

2011年,王洪波等[7]通過高通量篩選,發(fā)現(xiàn)4-硝基-7-(4-甲基哌嗪基)-苯并氧化呋咱(圖1,XI-006)是一類能夠抑制腫瘤細胞MDMX的表達,激活p53,保持腫瘤抑制基因活性的潛在抗腫瘤的代表化合物。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),苯環(huán)上胺基和硝基的位置影響苯并(氧化)呋咱衍生物的體外抗腫瘤活性[8]。為進一步增強該類化合物抗腫瘤活性,獲得結(jié)構(gòu)新穎的化合物,以XI-006為先導(dǎo)化合物,設(shè)計、合成了10個4,5-二取代苯并(氧化)呋咱類新衍生物(圖2)。并采用磺酰羅丹明B(SRB)比色法進行了體外抗腫瘤活性評價,發(fā)現(xiàn)化合物4a—4e對人非小細胞肺癌細胞NCI H460、乳腺癌細胞MCF-7及結(jié)腸癌細胞HCT-116具有較強的抑制作用,對MCF-7的IC50值小于1.0 μmol/L,對HCT-116的IC50值小于5.0 μmol/L,優(yōu)于先導(dǎo)化合物XI-006。

圖1 XI-006的結(jié)構(gòu)

圖2 目標化合物4a—4e及7a—7e的合成路線

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

WRS-1S數(shù)字熔點儀(上海易測儀器設(shè)備有限公司),溫度未經(jīng)校正;AVANCE-400型核磁共振儀(瑞士Bruker公司);Mariner型質(zhì)譜儀(美國Applied Biosystems公司);薄層層析硅膠(煙臺市化學工業(yè)研究所);試劑均為市售分析純。

1.2 合成步驟

1.2.1 2-硝基-4-氯疊氮苯(1)的合成 250 mL反應(yīng)瓶,加入30.0 mL乙酸、2-硝基-4-氯苯胺(2.75 g, 15.94 mmol)和10.0 mL濃硫酸,攪拌至全溶,降至0 ℃以下,緩慢滴加50.0 mL亞硝酸鈉(1.15 g, 16.67 mmol)水溶液,5 h反應(yīng)完全。滴加30.0 mL疊氮化鈉(1.05 g, 16.15 mmol)水溶液,轉(zhuǎn)移至室溫反應(yīng),TLC檢測至反應(yīng)不再正向進行,反應(yīng)體系用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7,用適量乙酸乙酯溶解,有機相依次用水和飽和氯化鈉溶液洗滌,無水硫酸鈉干燥。過濾,減壓濃縮,得黃褐色固體1(2.92 g),收率92.3%,直接用于下步反應(yīng)。

1.2.2 5-氯-苯并氧化呋咱(2)的合成 按文獻[9]方法合成,得亮黃色固體2(2.13 g),收率85.1%。直接用于下步反應(yīng)。

1.2.3 4-硝基-5-氯-苯并氧化呋咱(3)的合成 100 mL反應(yīng)瓶,加入12.0 mL濃硫酸和化合物2(1.02 g, 6.0 mmol),攪拌至全溶,降至0 ℃以下,緩慢滴加發(fā)煙硝酸(0.54 g, 8.57 mmol)和5.80 g濃硫酸混合液,4 h反應(yīng)完全。加入適量乙酸乙酯,有機相依次用水和飽和氯化鈉溶液洗滌,無水硫酸鈉干燥。過濾,減壓濃縮,硅膠柱層析,得黃色固體3(1.06 g),收率82.0%,mp:138～140 ℃。直接用于下步反應(yīng)。

1.2.4 5-氯苯并呋咱(5)的合成 按文獻[10]方法合成,得褐色油狀物5(1.84 g),收率98.9%。直接用于下步反應(yīng)。

1.2.5 4-硝基-5-氯苯并呋咱(6)的合成 100 mL反應(yīng)瓶,加入11.0 mL濃硫酸和5(0.94 g, 6.0 mmol),攪拌至全溶,降至0 ℃以下,緩慢滴加發(fā)煙硝酸(0.51 g, 8.09 mmol)和6.1 g濃硫酸混合液,4 h反應(yīng)完全。將反應(yīng)液倒入碎冰中,抽濾,用水洗滌濾餅,室溫干燥,得棕色固體6(446 mg),收率36.7%。直接用于下步反應(yīng)。

1.2.6 4-硝基-5-(4-甲基哌嗪)-苯并氧化呋咱(4a)的合成 50 mL反應(yīng)瓶,加入20.0 mL無水乙醇、3(100 mg, 0.46 mmol)和三乙胺(0.1 mL, 0.65 mmol),緩慢滴加5 mL 1-甲基哌嗪(93 mg, 0.93 mmol)的無水乙醇溶液,室溫反應(yīng)14 h,反應(yīng)完全。減壓濃縮,剩余物用適量氯仿溶解,有機相依次用水和飽和氯化鈉溶液洗滌,無水硫酸鈉干燥。過濾,減壓濃縮,硅膠柱層析,得紅色固體4a(70 mg),收率34.8%,mp: 136～139 ℃。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.32(1H, d,J=8.56 Hz, 7-H-Ar), 6.24(1H, d,J=8.6 Hz, 6-H-Ar), 3.45(4H, t,J=4.24 Hz, piperazine-2, 6-H), 2.67(4H, s, piperazine-3, 5-H), 2.40(3H, s,-CH3)。ESI-MS,m/z: 280.0[M+H+]。參照化合物4a的合成方法,合成化合物4b—4e,其外觀、總收率、熔點、1H NMR和ESI-MS 數(shù)據(jù)如下:

4-硝基-5-己胺基-苯并氧化呋咱(4b):橘紅色粉末,收率40.7%,mp: 101～103 ℃。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.66(1H, s,-NH-), 8.34(1H, d,J=9.12 Hz, 7-H-Ar), 6.24(1H, d,J=9.16 Hz, 6-H-Ar), 3.46(2H, s,-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 1.29～1.35(8H, m,-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 0.87(3H, t,J=6.08 Hz,-CH3)。ESI-MS,m/z: 281.1[M+H+]。

4-硝基-5-(4-異丙基哌嗪基)-苯并氧化呋咱(4c):深紅色粉末,收率32.9%,mp: 102～105 ℃。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.39(1H, d,J=8.8 Hz, 7-H-Ar), 6.46(1H, d,J=8.84 Hz, 6-H-Ar), 3.45(4H, t,J=4.44 Hz, piperazine-2, 6-H), 2.62(4H, t,J=4.68 Hz, piperazine-3, 5-H), 2.69～2.76(1H, m,-CH-), 1.0(6H, d,J=6.52 Hz,-(CH3)2)。ESI-MS,m/z: 308.1[M+H+]。

4-硝基-5-(4-異丁基哌嗪基)-苯并氧化呋咱(4d):棕色粉末,收率35.8%,mp: 135～138 ℃。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.40(1H, d,J=8.8 Hz, 7-H-Ar), 6.48(1H, d,J=8.84 Hz, 6-H-Ar), 3.46(4H, s, piperazine-2, 6-H), 2.50(4H, s, piperazine-3, 5-H), 2.10(2H, d,J=7.36 Hz,-CH2-), 1.75～1.85(1H, m,-CH-), 0.87(6H, d,J=6.48 Hz,-(CH3)2)。ESI-MS，m/z: 322.1[M+H+]。

4-硝基-5-高哌嗪基-苯并氧化呋咱(4e):棕色粉末,收率40.2%,mp: 95～97 ℃。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.10(1H, d,J=9.12 Hz, 7-H-Ar), 6.32(1H, d,J=9.16 Hz, 6-H-Ar), 4.10(2H, s, homopiperazine-2-H), 3.97(2H, s, homopiperazine-7-H), 2.76(2H, t,J=4.72 Hz, homopiperazine-3-H), 2.56(2H, t,J=5.2 Hz, homopiperazine-5-H), 2.28(3H, s,-CH3), 1.98～2.01(2H, m, homopiperazine-6-H)。ESI-MS,m/z: 294.1[M+H+]。

1.2.7 4-硝基-5-(4-甲基哌嗪基)苯并呋咱(7a)的合成 50 mL反應(yīng)瓶,加入6(130 mg, 0.64 mmol)、20 mL無水乙醇和三乙胺(0.1 mL, 0.72 mmol),攪拌至全溶,緩慢滴加5.0 mL 1-甲基哌嗪(130 mg, 1.28 mmol)的無水乙醇溶液,室溫反應(yīng)14 h,反應(yīng)完全。抽濾,室溫干燥,得淡黃色固體7a(113 mg),收率18.9%,mp: 203～205 ℃。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.10(1H, d,J=10.0 Hz, 7-H-Ar), 7.85(1H, d,J=10.0 Hz, 6-H-Ar), 3.49(4H, t,J=4.44 Hz, piperazine-2, 6-H), 2.58(4H, t,J=4.40 Hz, piperazine-3, 5-H), 2.40(3H, s,-CH3)。ESI-MS,m/z: 221.0[M+H+]。參照化合物7a的合成方法,合成化合物7b—7e,其外觀、總收率、熔點、1H NMR和ESI-MS 數(shù)據(jù)如下:

4-硝基-5-己胺基苯并呋咱(7b):黃綠色粉末,收率28.2%,mp: 83～84 ℃。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 10.67(1H, s,-NH-), 8.21(1H, d,J=10.0 Hz, 7-H-Ar), 7.74(1H, d,J=10.0 Hz, 6-H-Ar), 3.70(2H, dd,J=6.84, 13.88 Hz,-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 1.63～1.70(2H, m,-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 1.30～1.39(6H, m,-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 0.86(3H, t,J=6.84 Hz,-CH3)。ESI-MS,m/z: 287.06[M+H+]。

4-硝基-5-(4-異丙基哌嗪基)苯并呋咱(7c):黃色粉末,收率20.7%,mp: 169～171 ℃。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.07(1H, d,J=10.0 Hz, 7-H-Ar), 7.87(1H, d,J=10.0 Hz, 6-H-Ar), 3.52(4H, t,J=4.36 Hz, piperazine-2, 6-H), 2.66(4H, t,J=4.38 Hz, piperazine-3, 5-H), 2.69～2.76(1H, m,-CH-), 1.0(6H, t,J=7.36 Hz,-(CH3)2)。ESI-MS,m/z: 292.1[M+H+]。

4-硝基-5-(4-異丁基哌嗪基)苯并呋咱(7d):橘黃色粉末,收率21.3%,mp: 186～188 ℃。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.09(1H, d,J=10.0 Hz, 7-H-Ar), 7.89(1H, d,J=10.0 Hz, 6-H-Ar), 3.54(4H, t,J=4.64 Hz, piperazine-2, 6-H), 2.50～2.54(4H, m, piperazine-3, 5-H), 2.09(2H, d,J=7.40 Hz,-CH2-), 1.75～1.82(1H, m,-CH-), 0.87(6H, d,J=6.52 Hz,-(CH3)2)。ESI-MS,m/z: 306.1[M+H+]。

4-硝基-5-高哌嗪基苯并呋咱(7e):棕色粉末,收率27.4%,mp: 95～97 ℃。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.01(1H, d, J=10.0 Hz, 7-H-Ar), 7.79(1H, d,J=10.0 Hz, 6-H-Ar), 4.03(2H, s, homopiperazine-2-H), 3.89(2H, s, homopiperazine-7-H), 2.70～2.73(2H, m, homopiperazine-3-H), 2.49～2.52(2H, m, homopiperazine-5-H), 2.28(3H, s,-CH3), 1.99～2.02(2H, m, homopiperazine-6-H)。ESI-MS,m/z: 264.05[M+H+]。

1.3 體外抗腫瘤活性評價

將對數(shù)生長期的NCI H460、MCF-7及 HCT-116細胞,用5%培養(yǎng)基分別配置成濃度為4×104、3.5×104和 2×104個/mL的細胞懸液,并接種到96孔細胞培養(yǎng)板,每孔200 μL,培養(yǎng)24 h后去除原培養(yǎng)基,加入200 μL含5 μmol/L各目標物的培養(yǎng)基,每個濃度設(shè)4個平行孔;同時設(shè)陽性對照藥5-Fu組(測定對NCI H460的抑制率的濃度為500 μg/mL,對MCF-7、HCT-116的抑制率的濃度為200 μg/mL)和陰性對照組(0.1% DMSO)各6個平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h,每孔加入50 μL 50%TCA固定1 h,用去離子水沖洗5遍,甩干;干燥后加入100 μL SRB(4 mg/mL),室溫染色15 min,棄去染色液,用1%乙酸沖洗5次;干燥后每孔加入150 μL Tris-Bace溶液(10 mmol/L),水平搖床上振蕩20 min,用酶標儀測定540 mm下的吸光度A540。抑制率=[(A540對照孔-A540給藥孔)/A540對照孔]×100%。并測定對腫瘤細胞MCF-7及HCT-116有較好抑制作用的目標物4a—4eIC50值。

2 結(jié)果與討論

2.1 目標物的合成

首先以2-硝基-4-氯苯胺為原料環(huán)合得到氧化苯并呋咱環(huán),然后在無水乙醇中,室溫條件下,4-硝基-5-氯-苯并氧化呋咱(中間體3)與仲胺、4-取代哌嗪和取代(高)哌嗪通過親核取代反應(yīng),得到目標化合物4a—4e。隨著反應(yīng)的進行,逐漸生成較多固體,TLC檢測發(fā)現(xiàn),生成的雜質(zhì)較多,反應(yīng)完全后,抽濾,取少量固體,用甲醇溶解,TLC檢測,發(fā)現(xiàn)濾餅與母液的雜質(zhì)相同,因此將溶劑蒸除,與固體混合,經(jīng)氯仿萃取、干燥和硅膠柱層析,得到目標物。

純化后的4a—4e通過1H NMR確證結(jié)構(gòu),核磁圖譜顯示產(chǎn)品含有一定比例的異構(gòu)體。取代基為脂肪胺的化合物4b及取代基為甲基高哌嗪的化合物4e的異構(gòu)體含量為35%～39%,取代基為取代哌嗪的目標化合物4a、4c及4d的異構(gòu)體含量少于10%。TLC僅顯示一個點,推測兩個異構(gòu)體的極性相同或者相近。有文獻[11-12]報道,當溫度達到5-取代-4-硝基-苯并氧化呋咱的熔點時,該化合物會發(fā)生重排,生成4-取代-7-硝基-苯并氧化呋咱,當取代基為給電子基團時,室溫條件下也會發(fā)生重排。因此,以上結(jié)果與文獻報道一致。

目標化合物7a—7e則由相應(yīng)的苯并氧化呋咱,以三苯基膦作還原劑反應(yīng)得到。

2.2 體外抗腫瘤活性評價

SRB法初步評價目標化合物4a—4e及7a—7d的體外抗腫瘤活性,結(jié)果見表1。

表1 4a—4e及7a—7d對NCI H460、MCF-7和HCT-116細胞的體外增殖抑制率

藥理活性評價結(jié)果表明,濃度為5.0 μmol/L時,化合物4a—4e對NCI H460、MCF-7及HCT-116具有較強的抑制作用,多數(shù)化合物抑制率大于85.0%。7a—7d對三株腫瘤細胞的體外抑制活性較差,多低于50.0%。測定了對MCF-7及HCT-116兩腫瘤細胞有較好抑制作用目標物的 IC50值,4a—4e對MCF-7的IC50值小于1.0 μmol/L,對HCT-116的IC50值小于5.0 μmol/L,優(yōu)于先導(dǎo)化合物XI-006(IC50, MCF-7=5.8 μmol/L、IC50, HCT-116=15.3 μmol/L)。

表2 4a—4e對MCF-7及HCT-116腫瘤細胞的IC50

3 結(jié) 論

本研究共合成了10個 4,5-二取代苯并(氧化)呋咱類新衍生物。結(jié)果表明,濃度為 5.0 μmol/L 時,化合物4a—4e對人非小細胞肺癌細胞NCI H460、乳腺癌細胞MCF-7和結(jié)腸癌細胞HCT-116具有較強的抑制作用,多數(shù)化合物的抑制率大于85.0%;化合物7a—7d對三株腫瘤細胞的體外抑制活性較差,多低于50.0%,表明苯并氧化呋咱類似物的抗腫瘤作用較苯并呋咱類似物強。4a—4e對MCF-7的IC50值小于1.0 μmol/L,對HCT-116的IC50值小于5.0 μmol/L,優(yōu)于先導(dǎo)化合物XI-006。因此,4,5-二取代苯并氧化呋咱類衍生物具有進一步研究的價值。