王魯敏,肖翠平

(煙臺(tái)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,山東 煙臺(tái) 264005)

海綿(Marine sponge)是地球上最原始的無(wú)脊椎動(dòng)物,其獨(dú)特的空腔結(jié)構(gòu)和濾食性生活方式,使其擁有“微生物資源庫(kù)”的美譽(yù)[1]。近年來(lái),越來(lái)越多的研究表明從海綿中分離得到活性物質(zhì)需要微生物參與,有的甚至由微生物直接產(chǎn)生[2-4]。目前海洋微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物已逐步形成系統(tǒng)的研究體系,從海洋微生物中分離得到的化合物數(shù)量正在急劇增加[5]。近年來(lái)研究人員從海洋真菌中分離得到了大量結(jié)構(gòu)新穎的化合物,這些化合物往往具有廣泛的生物活性,如:抗病毒[6]、抗腫瘤[7]、抗污損[8]等。本文以分離自黃渤海潮間帶繁茂膜海綿(Hymeniacidonperleve)的一株共附生真菌Penicilliumsp.YZ-7為研究對(duì)象,對(duì)其次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化,分離得到9個(gè)化合物(結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1),并以海洋污損細(xì)菌為抗污損活性篩選模型對(duì)化合物進(jìn)行抗污損活性初步評(píng)價(jià)。

圖1 化合物1—9的結(jié)構(gòu)式

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器試劑

超導(dǎo)核磁共振波譜儀AVANCE III 500(德國(guó)Bruker公司;高分辨質(zhì)譜儀P776(美國(guó)Waters公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R206(上海申生科技有限公司);ODS反相硅膠(日本YMC公司);Sephadex LH-20凝膠(美國(guó)GE公司);氘代試劑(Cambridge Isotope Laboratories, Inc.);其他有機(jī)試劑均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 菌株分離與培養(yǎng)

分離鑒定:菌株YZ-7通過(guò)組織接種法分離自黃渤海潮間帶繁茂膜海綿Hymeniacidonperleve,經(jīng)ITS序列比對(duì)及形態(tài)學(xué)分析,確定種屬為Penicilliumsp.。菌種保存于中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所生物學(xué)與生物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱。

菌株培養(yǎng):取適量?jī)龃嬖?80 ℃的50%甘油中的菌種于裝有20 mL培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中,28 ℃搖床震蕩培養(yǎng)48 h獲得種子培養(yǎng)液。然后以1%的接種量轉(zhuǎn)接到裝有150 mL培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,28 ℃搖床震蕩培養(yǎng)48 h。然后以0.001接種量接種到裝有300 mL真菌培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方:蛋白胨5.0 g,酵母浸粉2.0 g,葡萄糖20.0 g,磷酸氫二鉀1.0 g,氯化鎂0.5 g,海水1000 mL,調(diào)節(jié)pH值至7～8)的1000 mL三角瓶中,共接種100瓶,于28 ℃靜態(tài)培養(yǎng)30 d。

1.3 提取與分離

代謝物提取:培養(yǎng)結(jié)束后,過(guò)濾分別得到發(fā)酵液上清液和菌絲體。發(fā)酵液上清液用乙酸乙酯萃取3次,得到發(fā)酵液乙酸乙酯提取物;菌絲體用甲醇浸泡24 h,提取3次,得到菌體甲醇提取物。合并得到粗浸膏46.3 g。

代謝物分離:總粗提物經(jīng)減壓硅膠柱層析(100～200目),用石油醚-丙酮體系50∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶5梯度洗脫,經(jīng)TLC分析,合并為8個(gè)組分(組分A—H)。組分C(151.1 mg)經(jīng)硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯=5∶1),得到2個(gè)亞組分C1和C2。其中,亞組分C1(36.5 mg)經(jīng)硅膠柱層析,以二氯甲烷為洗脫劑洗脫得到化合物1(22.0 mg)。組分D(175.6 mg)經(jīng)ODS反相硅膠柱層析(甲醇∶水=80∶20～100∶0,V/V),得到3個(gè)亞組分D1—D3。亞組分D1和D2經(jīng)硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯=8∶3)得到化合物2(10.6 mg)和化合物3(15.2 mg)。組分E(105.1 mg)經(jīng)ODS反相硅膠柱層析(甲醇∶水=70∶30～100∶0,V/V),再經(jīng)過(guò)反復(fù)的硅膠柱層析(二氯甲烷∶丙酮=5∶1,石油醚∶乙酸乙酯=1∶2)最終得到化合物4(12.8 mg)。組分F(2.2 g)經(jīng)ODS反相硅膠柱層析(甲醇∶水=60∶40～100∶0,V/V),得到3個(gè)亞組分F1、F2和F3。亞組分F1(1.2 g)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析(二氯甲烷∶甲醇=1∶1),得到2個(gè)次組分F11和F12。次組分F11和F22分別經(jīng)硅膠柱層析(二氯甲烷∶乙酸乙酯=1∶1,二氯甲烷∶甲醇=40∶1)最終得到化合物5(12.6 mg)、化合物6(9.2 mg)和化合物7(15.0 mg)。組分H(1.6 g)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析(甲醇洗脫),得到2個(gè)亞組分H1和H2。H1和H2再經(jīng)過(guò)硅膠柱層析(二氯甲烷∶甲醇=10∶1～1∶1梯度洗脫)最終得到化合物8(15.3 mg)和化合物9(18.6 mg)。

1.4 抗海洋污損細(xì)菌測(cè)試

將污損細(xì)菌菌株蘇云金芽孢桿菌B.thuringiensis、葉氏假交替單胞菌P.elyakovii、銅綠假單胞菌P.aeruginosa接種于海水LB培養(yǎng)基中,37 ℃搖床活化24 h,然后將菌懸液稀釋至106 CF/mL。采用濾紙片法[9]來(lái)半定量地對(duì)分離得到的化合物的抗菌活性進(jìn)行篩選,樣品用DMSO溶解,陰性對(duì)照組為DMSO,陽(yáng)性對(duì)照組為氯霉素。每個(gè)濾紙片上的樣品量為100 μg/片,每次3個(gè)平行,濾紙片直徑6.0 mm。37 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后用十字交叉法測(cè)量抑菌圈的大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1:無(wú)色固體,ESI-MS:m/z396[M]+, 379[M-OH]+。1H-NMR(500 MHz, CDCl3):δH5.59(1H, m, H-6), 5.41(1H, m, H-7), 5.24(1H, dd,J=15.6, 7.8 Hz, H-23), 5.19(1H, dd,J=15.6, 7.8 Hz, H-22), 3.66(1H, m, H-3), 1.06(3H, d,J=6.6 Hz, H-21), 0.97(3H, s, H-19), 0.94(3H, d,J=6.8 Hz, H-28), 0.86(3H, d,J=7.1 Hz, H-27), 0.85(3H, d,J=7.2 Hz, H-26), 0.66(3H, s, H-18);13C-NMR(125 MHz, CDCl3):δC141.4(s, C-8), 139.8(s, C-5), 135.6(d, C-22), 132.0(d, C-23), 119.6(d, C-6), 116.3(d, C-7), 70.5(d, C-3), 55.7(d, C-17), 54.6(d, C-14), 46.3(d, C-9), 42.8(s, C-13), 40.8(d, C-24), 40.8(t, C-4), 40.4(d, C-20), 39.1(t, C-12), 38.4(t, C-1), 37.0(s, C-10), 33.1(d, C-25), 32.0(t, C-2), 28.3(t, C-16), 23.0(t, C-15), 21.1(t, C-11), 21.1(q, C-21), 20.0(q, C-26), 19.6(q, C-27), 17.6(q, C-28), 16.3(q, C-19), 12.1(q, C-18)。化合物1核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]對(duì)照基本一致,被鑒定為麥角甾醇,分子式為C28H44O。

化合物2:無(wú)色晶體,APCI-MS:m/z429[M+H]+。1H-NMR(500 MHz, CDCl3):δH6.52(1H, d,J=8.5 Hz, H-7), 6.26(1H, d,J=8.5 Hz, H-6), 5.24(1H, dd,J=15.3, 7.6 Hz, H-23), 5.16(1H, dd,J=15.3, 8.3 Hz, H-22), 3.98(1H, m, H-3), 1.02(3H, d,J=6.6 Hz, H-21), 0.93(3H, d,J=6.9 Hz, H-28), 0.90(3H, s, H-19), 0.85(3H, d,J=6.9 Hz, H-27), 0.83(3H, s, H-18), 0.83(3H, d,J=6.8 Hz, H-26);13C-NMR(125 MHz, CDCl3):δC135.4(d, C-6), 135.2(d, C-22), 132.3(d, C-23), 130.7(d, C-7), 82.2(s, C-5), 79.4(s, C-8), 66.4(d, C-3), 56.2(d, C-17), 51.7(d, C-14), 51.1(d, C-9), 44.6(s, C-13), 42.8(d, C-24), 39.7(d, C-20), 39.3(t, C-12), 37.0(s, C-10), 36.9(t, C-4), 34.7(t, C-1), 33.1(d, C-25), 30.1(t, C-2), 28.6(t, C-15), 23.4(t, C-11), 20.9(q, C-21), 20.6(t, C-16), 20.0(q, C-27), 19.6(q, C-26), 18.2(q, C-19),17.6(q, C-28), 12.9(q, C-18)。化合物2核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]對(duì)照基本一致,被鑒定為(22E,24R)-5α,8α-epidioxy-ergosta-6,22-dien-3β-ol,分子式為C28H44O3。

化合物3:白色固體,APCI-MS:m/z427[M-H]-。1H-NMR(500 MHz, CDCl3):δH5.22(2H, m, H-22 and 23), 4.25(1H, brs, H-7), 3.98(1H, m, H-3), 3.34(1H, d,J=2.7 Hz, H-6), 1.16(3H, s, H-19),1.04(3H, d,J=6.6 Hz, H-21), 0.94(3H, d,J=6.8 Hz, H-28), 0.86(3H, d,J=7.0 Hz, H-27), 0.84(3H, d,J=7.0 Hz, H-26), 0.61(3H, s, H-18);13C-NMR(125 MHz, CDCl3):δC135.6(d, C-22), 134.5(s, C-8), 132.0(d, C-23), 126.9(s, C-9), 68.6(d, C-3), 67.1(d, C-7), 65.6(s, C-5), 62.6(d, C-6), 53.7(d, C-17), 49.6(d, C-14), 42.8(d, C-24), 42.1(s, C-13), 40.4(d, C-20), 39.2(t, C-4), 38.0(s, C-10), 35.7(t, C-12), 33.1(d, C-25), 30.9(t, C-1), 30.2(t, C-2), 29.0(t, C-16), 23.8(t, C-15), 23.4(t, C-11), 22.8(q, C-19), 21.0(q, C-21), 20.0(q, C-27), 19.6(q, C-26), 17.6(q, C-28), 11.3(q, C-18)。化合物3核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]對(duì)照基本一致,被鑒定為(22E,24R)-5α,6α-epoxy-ergosta-8,22-dien-3β,7α-diol,分子式為C28H44O3。

化合物4:紅色固體,EI-MS:m/z538[M]+。1H-NMR(500 MHz, 丙酮-d6):δH12.88(2×1H, s, 4,5-OH), 12.12(1H, s, 2-OH), 7.33(1H, s, H-6), 7.11(1H, s, H-8), 6.80(1H, s, H-3), 2.39(3H, s, 7-CH3);13C-NMR(125 MHz, 丙酮-d6):δC190.9(s, C-10), 182.1(s, C-9), 165.4(s, C-2), 164.1(s, C-4), 162.0(s, C-5), 148.5(s, C-7), 133.9(s, C-8a), 132.2(s, C-10a), 123.4(d, C-1), 122.7(d, C-6), 120.5(s, C-8), 113.4(s, C-9a), 110.0(s, C-4a), 107.6(d, C-3), 21.0(q, 7-CH3)。化合物4核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]對(duì)照基本一致,被鑒定為醌茜素,分子式為C30H18O10。

化合物6:無(wú)色晶體。1H-NMR(500 MHz, CD3OD):δH7.04(2H, d,J=8.6 Hz, H-2,6), 6.73(2H, d,J=8.6 Hz, H-3,5), 3.35(2H, t,J=7.5 Hz, H-7), 2.70(2H, t,J=7.5 Hz, H-8), 1.92(3H, s, H-2′);13C-NMR(125 MHz, CD3OD):δC171.8(s, C-1′), 155.5(s, C-4), 129.8(s, C-1), 129.3(d, C-2,6), 114.8(d, C-3,5), 41.0(t, C-7), 34.2(t, C-8), 21.1(q, C-2′)。化合物6核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]對(duì)照基本一致,被鑒定為N-乙?；野?分子式為C10H13NO2。

化合物7:無(wú)色晶體。1H-NMR(500 MHz, CDCl3):δH8.24(1H, brs, 1-NH), 7.63(1H, d,J=7.7 Hz, H-4), 7.41(1H, d,J=8.2 Hz, H-7), 7.24(1H, td,J=8.1, 1.1 Hz, H-6), 7.16(1H, td,J=8.0, 1.0 Hz, H-5), 7.06(1H, d,J=2.3 Hz, H-2), 3.63(2H, dd,J=12.7, 6.6 Hz, H-11), 3.00(2H, t,J=6.7 Hz, H-10), 1.95(3H, s, H-2′);13C-NMR(125 MHz, CDCl3):δC170.1(s, C-1′), 136.4(s, C-8), 127.4(s, C-9), 122.2(d, C-2), 122.0(d, C-6), 119.5(d, C-5), 118.7(d, C-4), 113.0(s, C-3), 111.3(d, C-7), 39.8(t, C-11), 25.3(t, C-10), 23.4(q, C-2′)?；衔?核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]對(duì)照基本一致,被鑒定為N-乙酰基色胺,分子式為C12H14N2O。

化合物8:無(wú)色晶體。1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6):δH4.40(2H, d,J=5.6 Hz, C2,5—O—H), 4.32(2H, t,J=5.7 Hz, C1,6—O—H), 4.13(2H, d,J=7.0 Hz, C3,4—O—H);13C-NMR(125 MHz, DMSO-d6):δC71.8(d, C-3, 4), 70.2(d, C-2, 5), 64.3(t, C-1, 6)?；衔?核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]對(duì)照基本一致,被鑒定為己六醇,分子式為C6H14O6。

化合物9:無(wú)色晶體。1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6):δH4.48(1H, d,J=5.5 Hz,), 4.44(1H, t,J=5.4 Hz), 4.34(1H, t,J=5.8 Hz), 4.22(1H, d,J=6.3 Hz), 4.15(H, d,J=7.4 Hz);13C-NMR(125 MHz, DMSO-d6):δC71.9(d, C-3), 71.0(d, C-2), 70.6(d, C-4), 64.2(t, C-1), 63.4(t, C-5)?；衔?核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]對(duì)照基本一致,被鑒定為木糖醇,分子式為C5H12O5。

2.2 抗海洋污損細(xì)菌活性評(píng)價(jià)

按照實(shí)驗(yàn)部分1.4所述方法對(duì)分離得到的化合物1—9進(jìn)行抗海洋污損細(xì)菌研究。從表1可以看出化合物1、3、4、5、6、7對(duì)這三種污損細(xì)菌均有一定的抑制作用,化合物3和4對(duì)三種污損細(xì)菌有中等強(qiáng)度的抑制作用,化合物2和8對(duì)三種污損細(xì)菌沒(méi)有抑制作用。

表1 化合物1—9的抗菌活性

3 結(jié) 論

從繁茂膜海綿共附生青霉屬真菌Penicilliumsp.YZ-7分離得到9個(gè)化合物,3個(gè)麥角甾醇類(lèi)化合物、醌茜素、1個(gè)二酮哌嗪、2個(gè)酰胺類(lèi)化合物、2個(gè)糖醇。以海洋污損細(xì)菌為抗污損活性篩選模型對(duì)化合物進(jìn)行抗污損活性初步評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)化合物(22E,24R)-5α,6α-epoxy-ergosta-8,22-dien-3β,7α-diol和醌茜素對(duì)三種污損細(xì)菌有中等強(qiáng)度的抑制作用。