馬山山，李佳鑫，陳雅婷，蔡鐘奇，白婧，劉傳斌，李泱*，曹雪濱

(1承德醫(yī)學(xué)院研究生院，河北 承德 067000；2解放軍陸軍第八十二集團軍醫(yī)院心腎內(nèi)科，河北 保定 071000；3河北大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000；4解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心心血管病醫(yī)學(xué)部研究所，北京100048)

隨著高原地區(qū)經(jīng)濟和旅游業(yè)突飛猛進的發(fā)展，越來越多的平原人前往高原地區(qū)。西部高原也是我國國防的重中之重，而平原地區(qū)部隊急進高原，尤其是在急進高原后進行強體力作業(yè)(搶險救災(zāi)、軍訓(xùn)軍演、爬山負重等)將引起機體尤其是心臟功能的損傷[1]。高原低氧環(huán)境對心臟功能的損傷導(dǎo)致心律失常事件增加已被廣泛認知[2，3]。急性運動后心率變異性增高，機體氧化應(yīng)激水平明顯升高，導(dǎo)致心功能降低，心律失常時間增加[4]。但急進高原低氧與強體力作業(yè)復(fù)合應(yīng)激刺激對心臟功能的影響研究較少，相關(guān)機制尚不清楚。

眾所周知，心律失常的基礎(chǔ)是心肌細胞電生理改變，急性缺氧和力竭運動均可改變心臟電生理，誘發(fā)心律失常[5，6]。瞬時外向鉀電流(transient outward potassium current，Ito)是心肌細胞復(fù)極化電流的一個重要成分，它主要參與了動作電位復(fù)極化的1 期和2期，其改變可引起復(fù)極異常，誘發(fā)心律失常[7]。雖然已有低氧狀態(tài)下Ito電流改變的研究，但目前尚未發(fā)現(xiàn)力竭運動是否也影響Ito，尤其是急性低氧和力竭運動復(fù)合應(yīng)激源刺激對Ito電流影響尚未見報道。本研究利用低壓氧艙聯(lián)合轉(zhuǎn)輪力竭運動制備大鼠應(yīng)激模型，利用膜片鉗技術(shù)記錄單個心房肌細胞Ito的變化，進一步探討其電流變化的門控機制，探究急進高原后進行強體力作業(yè)誘發(fā)心律失常的可能細胞電生理機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與溶液

膠原酶Ⅱ、胰蛋白酶、牛血清白蛋白、天門冬氨酸鉀、丙酮酸鈉、三磷酸腺苷鎂(magnesium adenosine triphosphate，MgATP)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸[4-(2-hydroxyerhyl)piperazine-1-erhanesulfonic acid，HEPEs]、CaCl2、CdCl2、BaCl2、4-氨基吡啶(4-aminopyridine，4-AP)、河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)、乙二醇醚二胺四乙酸(ethylene glycol ether diamine tetraacetic acid，EGTA)、多非利特均為美國希格瑪公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純。

臺氏液(Tyrode′s solution，Tyrode′s 液)的組成成份：NaCl 135.00 mmol/L，KCl 5.40 mmol/L，CaCl21.80 mmol/L，MgCl21.00 mmol/L，NaH2PO40.33 mmol/L，HEPEs 10.00 mmol/L，葡萄糖10.00 mmol/L，pH值用NaOH調(diào)至7.3；無鈣Tyrode液和0.20 mmol/L Ca2+Tyrode液，分別為Tyrode液中不加CaCl2和加0.20 mmol/L CaCl2。

記錄Ito電流的細胞外液：NaCl 140.0 mmol/L，MgCl25.0 mmol/L，CaCl20.5 mmol/L，HEPEs 5.0 mmol/L，CdCl20.1 mmol/L，用NaOH調(diào)pH值至7.2。

記錄Ito電流的細胞內(nèi)液：KCl 45 mmol/L，門冬氨酸鉀(K-aspartate)85 mmol/L，天冬氨酸鈉(Na-pytuvate)5 mmol/L，MgATP 5 mmol/L，EGTA 10 mmol/L，HEPEs 10 mmol/L，葡萄糖11 mmol/L，用KOH調(diào)pH值至7.4。

細胞保護液(KB solution，KB液)：KOH 110 mmol/L，?；撬?0 mmol/L，草酸10 mmol/L，谷氨酸70 mmol/L，KCl 25 mmol/L，KH3PO410 mmol/L，EGTA 5 mmol/L， HEPEs 5 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L，用KOH調(diào)至pH 7.4。

1.2 儀器

動物實驗氧艙(中國煙臺冰輪高氧艙有限公司，10-UWC800-02)、真空壓力表(中國青島工業(yè)儀表研究所，MC02000113)、數(shù)字智能測氧儀(中國北京航天鵬程儀器儀表有限公司，ML-I)、膜片鉗放大器(美國分子儀器公司，Axon-700B)。刺激信號及電壓輸入信號的采集應(yīng)用數(shù)模轉(zhuǎn)換器(美國分子儀器公司，Digidata 1440A)，處理軟件(美國分子儀器公司，pCLAMP10.4)。微電極拉制儀(日本成茂公司，pp-83)。

1.3 建立大鼠低氧運動模型

健康雄性清潔級SD大鼠40只，購買自解放軍總醫(yī)院動物中心，體質(zhì)量(160±15)g，實驗室環(huán)境下喂養(yǎng)7 d，使大鼠熟悉環(huán)境。將大鼠隨機分為以下4組，每組10只：低氧運動組(hypoxic exercise，HO-E)、低氧安靜組(hypoxic quiescent，HO-Q)、常氧運動組(normal oxygen exercise，NO-E)、常氧安靜組(normal oxygen quiescent，NO-Q)。參照文獻進行低壓氧艙/跑輪運動模擬試驗[8，9]，選擇2組低壓氧艙的大鼠，單只置于飼養(yǎng)籠或力竭運動跑輪中，分別放入低壓氧艙內(nèi)，關(guān)閉低壓氧艙艙門，打開負壓泵與負壓閥，控制降壓速度，使低壓氧艙氧分壓在25 min左右降低至61.6 kPa。其中HO-E組跑輪運動時間設(shè)定：總時間為4 h，每運行25 min停轉(zhuǎn)5 min，運行速度為18 m/min，正轉(zhuǎn)倒轉(zhuǎn)交替進行，試驗結(jié)束時打開泄壓閥，在25 min左右升壓至大氣壓；HO-Q組：在上述低氧條件下飼養(yǎng)4 h。待低壓氧艙內(nèi)氣壓穩(wěn)定至大氣壓后，開啟艙門取出跑輪和飼養(yǎng)籠。

選擇2組常氧的大鼠，單只置于飼養(yǎng)籠或力竭運動跑輪中，依照低氧組設(shè)定條件進行實驗。

1.4 大鼠單個心室肌細胞分離

參照文獻采用酶解法制備心室肌單細胞[10]。上述各組大鼠經(jīng)腹腔20%水合氯醛(2 ml/kg)麻醉，迅速取心臟，在37℃和通氧條件下行離體哺乳動物心臟灌流(Langendorff法)。用無Ca2+Tyrode′s 液灌流3～5 min，用含Ⅱ型膠原酶50 mg、胰蛋白酶8 mg無Ca2+Tyrode′s 液灌流(30 ml)15～20 min。沿房室間溝取心室肌，剪碎入KB液中并吹打使細胞脫落，并于2℃～8℃保存，1.0 h后進行實驗。取保存液加于1.0 ml灌流槽中，待細胞貼壁后，于倒置顯微鏡下選擇邊緣整齊、表面無顆粒、橫紋清晰、無收縮的細胞，室溫下進行實驗。

1.5 干擾電流的排除

于細胞外液加入多非利特5 nmol/L阻斷IKr，CdCl2100 μmol/L阻斷ICa-L，TTX 100 μmol/L阻斷INa。

1.6 膜片鉗全細胞記錄

采用全細胞膜片鉗記錄方法，在電壓鉗制下記錄電流。將膜片鉗放大器同計算機連接。刺激信號及電壓輸入信號的采集應(yīng)用數(shù)模轉(zhuǎn)換器，均由軟件控制。GG-17玻璃毛坯經(jīng)pp-83微電極拉制儀拉制成電阻為2.0～5.5 MΩ的電極。調(diào)節(jié)三維操縱器進行封接，使封接電阻達1 GΩ 以上，吸破細胞膜形成全細胞記錄模式。測定電容時，施以0.4 V/s的斜坡刺激，測電流并按方程Cm=I/(dV/dt)計算(Cm為膜電容，I為電流值，dV/dt即電壓斜率)。為消除細胞間的誤差，I值以電流密度(pA/pF)表示。信號經(jīng)截止頻率為1 kHz的四階貝塞爾低通濾波器濾波，采樣率為5 kHz。串聯(lián)電阻補償90%～95%以消除電壓偏差，液接電位補償校正至小于2 mV，慢電容補償約為85%～90%，以消除膜電容的充放電影響。

1.7 電流參數(shù)的設(shè)定[11]

Ito的峰值電流測定：在電壓鉗方式下，保持電位-80 mV，先給予-40 mV，20 ms的預(yù)刺激失活鈉電流，施予+40 mV，300 ms的去極化脈沖，可記錄到快速激活的外向電流，該電流被2 mmol/L的4-AP阻斷，即為Ito。

Ito電流-電壓曲線的繪制：在電壓鉗方式下，保持電位-80 mV，先給予-40 mV，20 ms預(yù)刺激失活鈉電流，再施予300 ms，階躍10 mV，-40 mV～+50 mV的系列去極化脈沖，求算電流密度。以各電壓下的電流密度與測試電壓作圖，得電流-電壓曲線。

Ito穩(wěn)態(tài)激活曲線的繪制：保持電位-80 mV，先給予-40 mV，20 ms的預(yù)刺激失活鈉電流，再施予500 ms，階躍為10 mV，-80 mV～+40 mV的系列去極化脈沖，可記錄到Ito電流，標準化各電流幅值，以相對電流對各膜電位作圖得穩(wěn)態(tài)激活曲線，并用Boltzmann方程I/Imax=1/{1 + exp[(Vm-V1/2)/k]}進行曲線擬合求出半激活電壓(V1/2)和激活曲線斜率(k)。

Ito穩(wěn)態(tài)失活曲線的繪制：保持電位-80 mV，施予1000 ms，階躍為10 mV，-90 mV～+20 mV的系列去極化脈沖在每一條件脈沖后緊跟一固定去極化至+40 mV，300 ms的測試脈沖，記錄Ito，標準化各電流幅值，以相對電流對各膜電位作圖得穩(wěn)態(tài)失活曲線，并用Boltzmann方程I/Imax=1/{1+exp[-(Vm-V1/2)/k]}進行曲線擬合求出半失活電壓(V1/2)和失活曲線斜率(k)。

Ito關(guān)閉態(tài)失活時間常數(shù)：鉗制電位-110 mV，給予+40 mV，300 ms的條件刺激，回復(fù)至-110 mV，再給予-65 mV，5、10、25、50、100、200、400、800 ms不同時間使通道失活，在每個時間間隔后緊接著一個+40 mV，300 ms的測試刺激，此過程用單項指數(shù)式擬合。

Ito失活后恢復(fù)曲線的繪制：鉗制電位-80 mV，給予+40 mV，300 ms的去極化脈沖，分別間隔40、80、160、320、640、1280、2560和5120 ms后，再施予第2次+40 mV，300 ms的方波刺激，將第2次方波脈沖引出的電流與條件刺激電流相比，按單項指數(shù)式：I=A×Exp(-t/τ)，求出恢復(fù)曲線的值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 急性低氧運動對大鼠心室肌細胞Ito電流密度的影響

在+40 mV時，NO-Q組、HO-Q組、NO-E組和HO-E組電流密度分別為 (28.2±3.2)、(17.6±1.9)、(14.5±2.1)和(9.8±1.1)pA/pF。HO-Q組、NO-E組、HO-E組與NO-Q組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。與常NO-Q組相比，NO-E組大鼠心室肌細胞的Ito電流密度明顯降低，說明急性低氧運動可明顯降低Ito電流密度，且較單獨急性低氧或力竭運動的效應(yīng)更加明顯(圖1)。

圖1 急性低氧運動對Ito電流幅值及電流密度的影響Figure 1 Effect of acute hypoxic exercise on Ito current amplitude and current density A: influence of acute hypoxic exercise on current amplitude; B: effect of acute hypoxic exercise on peak current density. Ito: transient outward potassium current; NO-Q: normal oxygen quiescent; HO-Q: hypoxic quiescent; NO-E: normal oxygen exercise; HO-E: hypoxic exercise. Compared with NO-Q group, *P<0.05, ** P<0.01.

2.2 急性低氧運動對大鼠心室肌細胞Ito作用的電壓依賴性

大鼠心肌細胞約在-10 mV 電位刺激時，Ito電流開始被激活，隨著刺激脈沖向去極化移動，電流密度逐漸增加，并呈現(xiàn)出明顯的外向整流特征。低氧運動后，各電壓下電流密度均降低，尤其是在+10 mV以上，隨著刺激電壓的增加電流密度降低更加明顯，提示低氧運動時大鼠心室肌細胞Ito的阻滯效應(yīng)具有電壓依賴性特征(圖2)。

圖2 急性低氧運動對Ito電流I-V曲線的影響Figure 2 Effect of acute hypoxic exercise on I-V curve of Ito current Ito: transient outward potassium current; I-V: voltage-current curve; NO-Q: normal oxygen quiescent; HO-Q: hypoxic quiescent; NO-E: normal oxygen exercise; HO-E: hypoxic exercise.

2.3 急性低氧運動對大鼠心室肌細胞Ito穩(wěn)態(tài)激活的影響

低氧運動后，大鼠心室肌細胞的Ito激活曲線明顯向去極化方向移動，NO-Q組半激活電壓(V1/2，act)為(-36.4±2.4)mV、而HO-Q組、NO-E組和HO-E組分別為(-32.8±3.5)、(-26.0±2.7)和(-17.9±2.1)mV。其中NO-E組、HO-E組與NO-Q組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。低氧運動對通道激活曲線斜率(kact)幾乎無影響(圖3)。進一步，單純低氧應(yīng)激較單純力竭運動均對通道半激活電壓有影響，但前者小于后者。

2.4 急性低氧運動對大鼠心室肌細胞Ito穩(wěn)態(tài)失活和關(guān)閉態(tài)失活的影響

研究結(jié)果顯示，低氧運動使大鼠心肌細胞Ito穩(wěn)態(tài)失活左移，半失活電壓(V1/2inact)數(shù)值增大，且低氧運動使通道的失活曲線斜率(kinact)增加，提示在相同刺激電位下，低氧運動后通道失活增加，有效通道數(shù)減少(圖4)。進一步，單純低氧應(yīng)激與單純力竭運動對通道半失活電壓的影響相似，而單純低氧應(yīng)激與單純力竭運動對通道失活斜率電壓的影響要小，且兩者之間存在顯著性差異(P<0.05)，提示單純低氧應(yīng)激降低Ito電流的門控機制由改變穩(wěn)態(tài)激活及穩(wěn)態(tài)失活電壓所致，而單純力竭運動降低Ito電流的門控機制主要來自穩(wěn)態(tài)失活斜率的改變。

圖3 急性低氧運動對Ito電流穩(wěn)態(tài)激活曲線的影響Figure 3 Effect of acute hypoxic exercise on steady-state activation curve of Ito current A: acute hypoxic exercise shifts the current steady-state activation curve to the right; B: acute hypoxic exercise shifts the semi-activated voltage to the correct voltage; C: acute hypoxic exercise causes the slope of the current steady-state activation curve to change less. Ito: transient outward potassium current; NO-Q: normal oxygen quiescent; HO-Q: hypoxic quiescent; NO-E: normal oxygen exercise; HO-E: hypoxic exercise. Compared with NO-Q group, *P<0.05, ** P<0.01.

圖4 急性低氧運動對Ito電流穩(wěn)態(tài)失活曲線的影響Figure 4 Effect of acute hypoxic exercise on steady-state inactivation curve of Ito current A: acute hypoxic exercise shifts the current steady-state inactivation curve to the left; B: acute hypoxic exercise shifts the half-inactivation voltage to a more negative voltage; C: acute hypoxic exercise increases the slope of the current steady-state inactivation curve. Ito: transient outward potassium current; NO-Q: normal oxygen quiescent; HO-Q: hypoxic quiescent; NO-E: normal oxygen exercise; HO-E: hypoxic exercise. Compared with NO-Q group, *P<0.05, ** P<0.01.

關(guān)閉態(tài)失活動力學(xué)結(jié)果顯示，低氧運動對關(guān)閉態(tài)失活曲線及電流的時間參數(shù)雖有影響，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示急性低氧運動抑制通道電流的作用與通道關(guān)閉態(tài)失活關(guān)系不大(圖5)。

2.5 急性低氧運動對大鼠心室肌細胞Ito失活后恢復(fù)曲線的影響

大鼠心室肌細胞Ito的失活后恢復(fù)在HO-E組顯著減慢，恢復(fù)時間常數(shù)(τ)明顯延長，NO-Q組、HO-Q組、NO-E組和HO-E組時間常數(shù)分別為(333.2±25.1)、(382.5±17.8)、(430.2±31.6)和(464.2±29.7)ms，可見低氧聯(lián)合力竭運動后Ito的恢復(fù)曲線明顯右移，提示通道失活后恢復(fù)過程減慢(圖6)。

圖5 急性低氧運動對Ito電流關(guān)閉態(tài)失活動力學(xué)的影響Figure 5 Effect of acute hypoxic exercise on inactivation mechanics of Ito current closed state Ito: transient outward potassium current; NO-Q: normal oxygen quiescent; HO-Q: hypoxic quiescent; NO-E: normal oxygen exercise; HO-E: hypoxic exercise.

圖6 急性低氧運動對Ito電流失活后恢復(fù)動力學(xué)的影響Figure 6 Effect of acute hypoxic exercise on recovery kinetics after Ito current inactivation A: acute hypoxic exercise makes the recovery curve shift to the right after the current is inactivated; B: acute hypoxic exercise increases the recovery time constant after the current is inactivated. Ito: transient outward potassium current; NO-Q: normal oxygen quiescent; HO-Q: hypoxic quiescent; NO-E: normal oxygen exercise; HO-E: hypoxic exercise. Compared with NO-Q group, *P<0.05.

3 討 論

高原低氧環(huán)境和運動應(yīng)激均能對心臟功能造成損傷，研究顯示，急進高原人員心臟功能明顯降低，心電圖發(fā)生顯著變化，易誘發(fā)心律失常的發(fā)生[12，13]。但急進高原低氧環(huán)境中運動應(yīng)激復(fù)合刺激影響心肌電生理及心律失常的機制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，在急性低氧聯(lián)合力竭運動的大鼠模型中，心室肌細胞的Ito降低，而且較單獨低氧或運動的效應(yīng)更加明顯。Ito電流的大小對動作電位的形態(tài)和時程有較大影響，主要與動作電位的復(fù)極1相有關(guān)。研究顯示，當心肌應(yīng)激時，Ito作為復(fù)極早期的重要電流，其電流密度降低將誘發(fā)心律失常[14]。本研究結(jié)果提示急性低氧運動導(dǎo)致心律失常發(fā)生的機制很可能與其阻滯心室肌細胞細胞膜Ito電流、延長動作電位時程、導(dǎo)致心肌細胞復(fù)極異常有關(guān)。

通過門控機制研究，我們發(fā)現(xiàn)Ito電流降低主要與急性低氧運動后通道穩(wěn)態(tài)激活和穩(wěn)態(tài)失活過程有關(guān)，使相同電位刺激時，通道開放降低，失活增加，從而降低有效通道的數(shù)量，引起Ito電流密度降低。同時，電流降低還與急性低氧運動使通道失活后恢復(fù)動力學(xué)減緩，恢復(fù)時間常數(shù)增加有關(guān)，進一步延緩了心肌的動作電位時程[15]。但急性低氧運動對通道關(guān)閉態(tài)失活動力學(xué)幾乎沒有影響。本研究結(jié)果顯示，單純低氧應(yīng)激與單純力竭運動均可降低Ito密度，但兩者Ito通道的門控機制效應(yīng)卻不相同，單純低氧應(yīng)激比單純力竭運動對通道失活斜率電壓的影響更小，提示單純低氧應(yīng)激降低Ito電流的門控機制由改變穩(wěn)態(tài)激活及穩(wěn)態(tài)失活電壓所致，力竭運動降低Ito電流的門控機制主要來自穩(wěn)態(tài)失活斜率的改變。

本實驗局限性在于未能深入探究調(diào)節(jié)Ito通道蛋白的相關(guān)基因。我們知道，一個離子通道電流的改變，主要來自兩個方面：(1)通道門控機制的變化，包括通道穩(wěn)態(tài)激活、穩(wěn)態(tài)失活過程、激活與失活動力學(xué)及失活后恢復(fù)動力學(xué)的改變[11]；(2)細胞膜有效通道數(shù)量的變化，可能由于通道基因合成、轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后修飾，尤其是通道蛋白從高爾基體向細胞膜的轉(zhuǎn)運過程改變[16]，而基因和蛋白的表達，特別是Kv4.2/Kv4.3蛋白在細胞膜的表達，直接影響Ito電流密度的大小，這在今后的工作中需要補充研究。

本研究結(jié)果顯示，心肌細胞瞬時外向鉀電流的變化作為影響心肌電生理的基礎(chǔ)，是急性低氧運動導(dǎo)致心律失常的重要機制之一，為相關(guān)復(fù)合應(yīng)激刺激引起的心肌損傷和心律失常的機制探討提供理論依據(jù)。