王 浩，方 芳，王杰鵬，劉惠聰，蘇小霞，李 宓，甄曉靜，胡薇薇，方朝義△

(1.河北中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，石家莊 050011； 2.河北省中西醫(yī)結(jié)合肺病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050091； 3. 河北中醫(yī)學(xué)院，石家莊 050200； 4. 石家莊市中醫(yī)院，石家莊 050051)

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)是以胃黏膜上皮遭受反復(fù)損害導(dǎo)致胃黏膜腺體萎縮變薄、胃肌層變厚且伴或不伴腸腺化生和(或)假幽門腺化生的一種慢性胃部疾病[1-3]。在我國(guó)，CAG發(fā)病率居胃病發(fā)病之首并呈年輕化趨勢(shì)，世界衛(wèi)生組織更將其列為胃癌發(fā)展的癌前狀態(tài)[4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚未完全闡明CAG的發(fā)病機(jī)制，多認(rèn)為其系多種因素綜合作用的結(jié)果。中醫(yī)學(xué)采用綜合療法治療CAG取得了顯著的臨床療效[5]。芍藥八味湯是臨床治療胃脘痛的經(jīng)驗(yàn)方[6]。前期研究結(jié)果顯示，該方藥可改善大鼠胃腸動(dòng)力和消化機(jī)能[7]。本研究擬通過(guò)觀察該方藥對(duì)CAG大鼠血清及胃組織中增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)和促生長(zhǎng)素(growth hormone，GH)的影響，進(jìn)一步揭示其對(duì)胃黏膜產(chǎn)生保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)110只健康Wistar大鼠，6周齡，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)1003122。飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，光照黑暗各12 h。

1.2 主要藥物

芍藥八味湯組成：白芍30 g，廣木香9 g，砂仁6 g，陳皮10 g，枳殼15 g，厚樸12 g，郁金12 g，炙甘草6 g，購(gòu)自石家莊樂(lè)仁堂藥店。經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院中藥藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室鑒定為合格藥材，并由該實(shí)驗(yàn)室煎煮濃縮：飲片加水浸泡30 min，先以武火煮至沸騰，后調(diào)至文火，每副藥物煎煮2次，將所得煎液混合，分別濃縮為含有生藥量1.042 g/mL(相當(dāng)于臨床成人用藥量的7倍)、2.084 g/mL(相當(dāng)于臨床成人用藥量的14倍)的水煎劑，4 ℃冰箱存用。維霉素片(批號(hào)20091221，規(guī)格0.2 g/片)，鄭州復(fù)升藥業(yè)有限公司。

1.3 主要試劑

氨水(批號(hào)20080714，含氨氣25.0%～28.0%)，沈陽(yáng)新興試劑廠；脫氧膽酸鈉(批號(hào)090511)，美國(guó)Sigma公司；PCNA、GH、EGF和VEGF酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒、PCNA、VEGF兔抗大鼠多克隆抗體、鏈霉素-辣根過(guò)氧化物酶-生物素(streptaridin-peroxidase，SP)超敏試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)染色液，石家莊勃盛化學(xué)試劑有限公司。

1.4 主要儀器

1-15 K型高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)；BX60型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；CM1900型組織切片機(jī)(德國(guó)LEICA公司)；HI1210型攤片機(jī)(德國(guó)LEICA公司)；Max M5型酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices spectra公司)。

1.5 分組、模型制備及給藥

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為空白對(duì)照組(20只)和CAG造模組(90只)，采用復(fù)合造模法復(fù)制CAG大鼠模型[8]。自造模首日始，每單日自由飲用脫氧膽酸鈉(以蒸餾水配成20 mmol/L的溶液，pH 7.0～7.8)，每雙日自由飲用0.1%氨水，同時(shí)配合饑飽失常法(2 d足食，1 d禁食)，連續(xù)造模90 d。

90 d后隨機(jī)抽取6只造模組大鼠，取胃組織行蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)，光鏡觀察胃組織病理形態(tài)改變。確認(rèn)造模成功后，將80只(造模期間4只大鼠死亡，另6只大鼠行HE染色確認(rèn)模型復(fù)制成功)造模大鼠再隨機(jī)分為模型組、芍藥八味湯高、低劑量組和維酶素組每組各20只。

模型復(fù)制成功后第2天始灌胃每日1次，連續(xù)灌胃30 d?？瞻讓?duì)照組和模型組灌服生理鹽水(10 mL/kg)，芍藥八味湯高、低劑量組分別灌服高、低濃度芍藥八味湯煎液(10 mL/kg)，維霉素組灌服維霉素混懸液(0.96 g/kg，相當(dāng)于臨床成人用藥量的14倍)。

1.6 取材

大鼠末次給藥后禁食不禁水24 h。乙醚麻醉后摘取雙側(cè)眼球取血3 mL，靜置2 h后離心3500 r/min，15 min，提取血清-20 ℃凍存待檢。繼以頸椎脫臼法處死大鼠取全胃，剪取胃小彎側(cè)近幽門部大小約0.3 cm×0.5 cm的組織塊，置于10%甲醛溶液固定；另稱取濕重0.2 g的胃組織置于EP管中，加入1 mL生理鹽水，電動(dòng)勻漿器勻漿，離心4℃6000 r/min，5 min，提取上清液-20 ℃凍存待檢。

1.7 檢測(cè)指標(biāo)

1.7.1 大鼠一般生物學(xué)表征觀察 觀察大鼠活動(dòng)、精神狀態(tài)、毛發(fā)光澤度及二便等情況。

1.7.2 HE染色 取固定的胃組織行HE染色，鏡下觀察大鼠胃組織病理形態(tài)改變。

1.7.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)PCNA、GH、EGF、VEGF含量 依據(jù)試劑盒操作說(shuō)明書檢測(cè)PCNA、GH、EGF、VEGF含量。

1.7.4 免疫組織化學(xué)染色觀察胃組織中PCNA、VEGF蛋白表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色(SP法)觀察胃組織中PCNA、VEGF蛋白表達(dá)情況。以軟件Image-Pro Plus 6.0測(cè)量大鼠胃組織積分光密度(integrated optical density，IOD)和陽(yáng)性表達(dá)面積(area)，計(jì)算平均光密度(IOD/area)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般生物學(xué)表征觀察結(jié)果

空白對(duì)照組大鼠被毛貼身緊密，光澤明潤(rùn)，目珠轉(zhuǎn)動(dòng)靈活，活動(dòng)量大，動(dòng)作敏捷，大便呈橢圓形顆粒狀，耳色及尾尖淡紅。模型組大鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡，活動(dòng)緩慢，反應(yīng)遲鈍，喜扎堆，拱背，便溏，耳及四肢爪甲色淡白，皮毛色澤枯槁易脫落，嚴(yán)重者驚動(dòng)時(shí)神情呆鈍，抓取時(shí)掙扎少力，大便干稀不調(diào)。各治療組用藥后上述表現(xiàn)逐漸好轉(zhuǎn)，尤以芍藥八味湯高劑量組改善明顯。

2.2 大鼠胃黏膜組織病理形態(tài)學(xué)觀察

2.2.1 肉眼觀察 空白對(duì)照組胃黏膜呈淡紅色，黏膜皺襞表面光滑規(guī)整，伸展性好有光澤，表面覆有少量黏液。模型組胃黏膜粗糙，色澤灰暗，可見點(diǎn)狀或片狀出血，表面黏液減少，皺襞低平、稀少甚至消失，走向紊亂。

2.2.2 光學(xué)顯微鏡觀察 圖1示，空白對(duì)照組大鼠胃黏膜上皮完整，細(xì)胞排列整齊且形態(tài)規(guī)則，呈單層柱狀；固有層內(nèi)呈現(xiàn)大小形狀較為一致且密集排列的腺體，腺上皮和腺管分界清楚，細(xì)胞呈柱狀或圓錐狀，胞漿透明或呈小空泡狀，偶見散在的淋巴細(xì)胞，肌層均勻無(wú)增生。模型組大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞萎縮變薄、變性、壞死、脫落，固有層腺體排列紊亂、疏松，腺體和腺細(xì)胞數(shù)目減少，體積變小，可見淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤(rùn)，部分有淋巴濾泡形成，可見腸上皮化生。治療組炎癥程度均較模型組減輕，胃黏膜炎癥以輕中度為主，未見重度炎癥，尤以芍藥八味湯高劑量組改善明顯。

2.2.3 ELISA檢測(cè)大鼠血清中EGF、VEGF、GH含量結(jié)果 表1示，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠EGF、VEGF含量升高，GH含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，各用藥組大鼠EGF、VEGF含量下降，GH含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與維酶素組比較，芍藥八味湯高劑量組大鼠EGF水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；芍藥八味湯高、低劑量組GH水平均有明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 各組大鼠血清中EGF、VEGF、GH含量比較

2.3 ELISA檢測(cè)大鼠胃組織PCNA含量結(jié)果

表2示，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠PCNA含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，各用藥組大鼠PCNA含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.4 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)大鼠胃組織PCNA、VEGF蛋白表達(dá)結(jié)果

圖2、3表2示，與空白對(duì)照組比較，模型組PCNA與VEGF表達(dá)量明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，用藥組PCNA與VEGF表達(dá)均明顯降低(P<0.01)。與維酶素組比較，芍藥八味湯低劑量組PCNA、VEGF平均光密度明顯升高(P<0.01)。

表2 各組大鼠胃組織中PCNA與VEGF水平比較

3 討論

胃黏膜損傷和固有腺體萎縮是CAG典型的病理改變[9]，臨床主要表現(xiàn)為上腹部隱痛、脹滿、噯氣、食欲不振等[10]。該病的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確且缺乏理想藥物。CAG是在多種因素共同作用下的結(jié)果，學(xué)者多采用更符合疾病臨床特點(diǎn)的多因素綜合造模方法建立動(dòng)物模型，以探究CAG的發(fā)生發(fā)展規(guī)律[11]。本實(shí)驗(yàn)采用自由飲用脫氧膽酸鈉和氨水，配合饑飽失常法復(fù)制CAG大鼠模型，其中自由飲用氨水系模擬幽門螺桿菌感染后高氨狀態(tài)對(duì)胃黏膜的毒性損害，饑飽失常法是模擬人體飲食不節(jié)損傷脾胃。結(jié)果顯示，模型組大鼠胃組織萎縮變薄，腺體體積變小，淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤(rùn)，伴見腸上皮化生，證實(shí)本實(shí)驗(yàn)采用復(fù)合因素造模方式成功復(fù)制CAG大鼠模型。

PCNA具有參與細(xì)胞調(diào)控、DNA損傷修復(fù)與甲基化、染色體重塑等重要生物學(xué)功能[12]，是反映細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)，與DNA復(fù)制密切相關(guān)。VEGF被認(rèn)為是參與微血管新生的重要因子。研究證實(shí)，CAG患者血清中VEGF水平較正常人群明顯升高，且被認(rèn)為與胃癌癌前病變密切相關(guān)[13]。EGF是一種對(duì)多種組織細(xì)胞有強(qiáng)烈促分裂作用的生長(zhǎng)因子，可刺激胃黏膜上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)能通過(guò)抑制胃酸分泌、增強(qiáng)胃黏膜黏液的分泌和增加胃黏膜血流量等機(jī)制對(duì)胃黏膜起到保護(hù)作用[14]，其過(guò)度表達(dá)可引起組織細(xì)胞異常增生、代謝增強(qiáng)，被認(rèn)為是引起癌變的重要因子[15]。GH是一種具有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)功能的單肽鏈蛋白質(zhì)激素，對(duì)胃黏膜上皮細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)和分化有直接調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，CAG大鼠胃組織PCNA含量升高，血清VEGF和EGF含量增加，提示大鼠胃黏膜受到損傷，胃黏膜細(xì)胞過(guò)度增殖，DNA復(fù)制受損；血清GH水平上高，意味著胃黏膜上皮細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)和分化受到損傷?？梢姡珻AG大鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中存在明顯的胃黏膜受損、修復(fù)/損傷機(jī)制失調(diào)。

結(jié)合文獻(xiàn)以及課題組臨床診治CAG經(jīng)驗(yàn)，我們認(rèn)為CAG的發(fā)生主要責(zé)之于肝氣郁結(jié)與素體脾胃虧虛，病位主要在肝和脾胃。肝氣郁結(jié)，橫犯脾胃，遂致升降失常；氣機(jī)郁滯、血行不暢又致瘀血內(nèi)停。素體脾胃既虛，運(yùn)化失司，濕聚難化，內(nèi)生濕熱。驗(yàn)方芍藥八味湯重用白芍為君，養(yǎng)血柔肝，緩中止痛?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，白芍具有抗炎、鎮(zhèn)痛、保護(hù)胃黏膜等作用[16-17]；木香、砂仁、陳皮、枳殼、厚樸行中焦氣滯，散中焦?jié)裉N(yùn)，其中木香可抗幽門螺桿菌、促進(jìn)胃動(dòng)力和抗胃潰瘍、保護(hù)胃黏膜等[18-19]；郁金活血止痛、行氣解郁；炙甘草調(diào)和諸藥、和中補(bǔ)虛。諸藥合用契合CAG之病機(jī)。本研究結(jié)果提示，芍藥八味湯后可下調(diào)PCNA、VEGF、EGF表達(dá)，上調(diào)GH含量，說(shuō)明芍藥八味湯可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)代謝，抑制微血管再生，促使CAG大鼠胃黏膜修復(fù)與損傷之間協(xié)調(diào)與平衡，從而保護(hù)胃黏膜。