許明　劉笑萌　艾坤　鄧石峰　張雨辰　何可　姜珊多嬌　張泓

〔摘要〕 目的 觀察電針對完全性骶上脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱大鼠尿流動力學(xué)及髓內(nèi)神經(jīng)生長因子（NGF）和神經(jīng)營養(yǎng)素3（NT-3）表達(dá)水平的影響。方法 選取60只雌性SD大鼠，隨機抽取24只分為空白組和假手術(shù)組（各12只），其余36只大鼠采用脊髓橫斷法進行手術(shù)造模，再選取經(jīng)評價符合模型標(biāo)準(zhǔn)的24只大鼠隨機分為模型組和電針組（各12只），模型成功后各組予以相應(yīng)干預(yù)，連續(xù)7 d。各組動物行尿流動力學(xué)評估后處死，取膀胱組織切片觀察逼尿肌功能，取脊髓組織用Western blot法和RT-PCR法測定髓內(nèi)NGF和NT-3的表達(dá)。結(jié)果 HE染色結(jié)果提示，與空白組、假手術(shù)組比較，模型組膀胱上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，逼尿肌肌纖維增生，有嚴(yán)重出血改變;與模型組比較，電針組完整膀胱上皮細(xì)胞增多，逼尿肌肌纖維增生程度減輕，出血改變減少。尿流動力學(xué)結(jié)果提示，與空白組、假手術(shù)組比較，模型組膀胱最大容量及順應(yīng)性均明顯降低（P<0.01），膀胱漏尿點壓增加（P<0.01）;與模型組比較，電針組膀胱最大容量及順應(yīng)性均明顯增加（P<0.01），膀胱漏尿點壓降低（P<0.01）。Western blot結(jié)果和RT-PCR結(jié)果提示，與空白組、假手術(shù)組比較，模型組髓內(nèi)NGF蛋白及其mRNA含量明顯降低（P<0.01），NT-3蛋白及其mRNA含量明顯增加（P<0.01）;與模型組比較，電針組髓內(nèi)NGF、NT-3蛋白及其mRNA含量均升高（P<0.05）。結(jié)論 電針次髎、中極、三陰交、大椎可升高骶上脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱大鼠脊髓組織中NGF和NT-3蛋白及其mRNA含量，改善膀胱神經(jīng)支配，提高受累膀胱儲尿控尿的能力。

〔關(guān)鍵詞〕 電針;骶上脊髓損傷;神經(jīng)源性膀胱;尿流動力學(xué);神經(jīng)生長因子;神經(jīng)營養(yǎng)素3

〔中圖分類號〕R245? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.02.017

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of electroacupuncture on urodynamics and expression of intramedullary nerve growth factor （NGF） and neurotrophin 3 （NT-3） in neurogenic bladder rats after complete sacral spinal cord injury. Methods 60 female SD rats were selected， 24 rats were randomly divided into the blank group and the sham operation group （12 rats in each group）， the remaining 36 rats were operated by transection of spinal cord， then 24 rats that met the model criteria were randomly divided into the model group and the electroacupuncture group （12 rats in each group）， after the model was successful， each group intervened for 7 consecutive days. The animals were killed after urodynamic evaluation， bladder tissue sections were taken to observe detrusor function， the expressions of intramedullary NGF and NT-3 were determined by Western blot method and RT-PCR method. Results HE staining results indicated， compared with the blank group and the sham operation group， there were structural disruption of bladder epithelial cells in the model group， with fibre proliferation of the detrusor and severe bleeding changes; compared with the model group， the number of intact bladder epithelial cells in the electroacupuncture group increased， the degree of myofibrillar hyperplasia of the detrusor was reduced， and bleeding changes decreased. Urodynamic results suggested， compared with the blank group and the sham operation group， both bladder maximum capacity and compliance were significantly decreased in the model group （P<0.01）， with the bladder leak point pressure increased （P<0.01）; compared with the model group， both bladder maximum capacity and compliance increased significantly in the electroacupuncture group （P<0.01）， with the bladder leakage point pressure decreased （P<0.01）. Western blot and RT-PCR results indicated that the content of intramedullary NGF protein and its mRNA decreased significantly （P<0.01）， and the content of the NT-3 protein and its mRNA increased significantly （P<0.01） in the model group compared with the blank group and the sham operation group. Compared with the model group， the contents of NGF， NT-3 protein and its mRNA in the electroacupuncture group increased （P<0.05）. Conclusion Electroacupuncture of "Ciliao" （BL32）， "Zhongji" （RN3）， "Sanyinjiao" （SP6） and "Dazhui" （DU14） can increase the contents of NGF and NT-3 protein and its mRNA in spinal cord of neurogenic bladder rats after sacral spinal cord injury， improve bladder innervation and improve the ability of urine storage and control in affected bladder.

1.6.4? Western blot檢測脊髓組織中NGF和NT-3蛋白含量? 細(xì)胞裂解法提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，經(jīng)10% SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉后采用1∶500（NGF）、1∶2 000（NT-3）的一抗稀釋比例，于4 ℃下孵育，二抗稀釋比例為1∶3 000，ECL顯影，采用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)拍照，QuantityOne軟件分析目的蛋白和內(nèi)參β-actin蛋白的灰度值，以兩者灰度值的比值作為NGF和NT-3蛋白的相對表達(dá)水平。

1.6.5? RT-PCR檢測脊髓組織內(nèi)NGF mRNA和NT-3

mRNA表達(dá)? 取保存在Trizol中的脊髓組織約0.02 g，提取細(xì)胞內(nèi)RNA總量，以組織總mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，運用Primer 5軟件設(shè)計引物，有南京金斯瑞合成引物，引物信息見表1。定量PCR擴增程序依次為95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，退火60 ℃反應(yīng)30 s，40個循環(huán)。

1.7? 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 25.0軟件進行處理，實驗數(shù)據(jù)用“x±s”表示。所有資料進行正態(tài)性檢驗，均符合正態(tài)分布者，用單因素方差分析。均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 一般情況的觀察

造模1周后，模型大鼠各項體征逐步穩(wěn)定，此時大鼠處于脊髓休克期，進食飲水較前稍少，排尿排便需部分輔助，至造模后18 d，模型大鼠基本出現(xiàn)穩(wěn)定的逼尿肌亢進表現(xiàn)，造模成功后各組未出現(xiàn)大鼠自噬和死亡。因SCI對胃腸道功能產(chǎn)生一定影響，模型大鼠體質(zhì)量稍減輕。

2.2? 各組大鼠膀胱組織形態(tài)學(xué)變化

模型組中逼尿肌纖維的數(shù)量和層次顯著高于空白組及假手術(shù)組，同時可見固有層及黏膜層附近有出血、炎性及水腫改變，部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞。電針組膀胱逼尿肌纖維的數(shù)量和層次輕度增高，固有層及黏膜層附近少量出血，少數(shù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞。見圖1。

2.3? 各組大鼠尿流動力學(xué)評估結(jié)果

空白組與假手術(shù)組膀胱最大容量、漏尿點壓及順應(yīng)性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;與空白組及假手術(shù)組比較，模型組的膀胱最大容量及順應(yīng)性均明顯降低（P<0.01），漏尿點壓力明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，電針組的膀胱最大容量及順應(yīng)性明顯增加（P<0.01），漏尿點壓力降低（P<0.05）。見表2。

2.4? 各組大鼠髓內(nèi)細(xì)胞中NGF及NT-3蛋白表達(dá)水平的比較

空白組與假手術(shù)組NGF及NT-3蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;與空白組及假手術(shù)組比較，模型組NGF蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.01），NT-3蛋白表達(dá)量明顯增加（P<0.01）;與模型組比較，電針組NGF及NT-3蛋白表達(dá)量均增加（P<0.05）。見圖2、表3。

2.5? 各組大鼠髓內(nèi)細(xì)胞NGF mRNA及NT-3 mRNA表達(dá)量的比較

空白組與假手術(shù)組NGF mRNA及NT-3mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;與空白組及假手術(shù)組比較，模型組NGF mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.01），NT-3 mRNA表達(dá)量明顯增加（P<0.01）;與模型組比較，電針組NGF mRNA及NT-3 mRNA表達(dá)量增加（P<0.05）。見表4。

3 討論

《諸病源候論》有“小便不禁者，腎氣虛”“不能溫制其水液，故小便不禁也”的描述。骶上SCI后引起的逼尿肌反射亢進型NB，臨床以尿失禁為主要表現(xiàn)，屬中醫(yī)學(xué)“遺溺”“小便不禁”范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，患者脊髓外傷后，督脈受損，膀胱和下焦之氣受阻，導(dǎo)致氣滯血瘀，腎氣受損，膀胱氣化功能失調(diào)，引起治療時應(yīng)以疏通調(diào)理膀胱和下焦之氣為大法[11]。黃宇等[12]利用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)分析針灸治療NB的經(jīng)穴應(yīng)用規(guī)律特點，通過從多個數(shù)據(jù)庫中篩選近10年針灸治療NB的臨床研究類文獻(xiàn)，最終納入82篇文獻(xiàn)，得出結(jié)論如下：（1）常用經(jīng)脈為足太陽膀胱經(jīng)、任脈、足太陰脾經(jīng);（2）常用有效穴位為中極、三陰交、次髎，使用頻次累及537次;（3）腧穴分布在腰骶部、下腹部、四肢部。本研究中選擇次髎、中極、三陰交、大椎穴進行電針干預(yù)，其中：大椎穴位于督脈，本經(jīng)取穴，治病求本，保護脊髓神經(jīng)元的功能，從而改善膀胱神經(jīng)支配;次髎穴為膀胱經(jīng)腧穴，位于骶部，針刺次髎能調(diào)理膀胱經(jīng)氣，促進膀胱與腎對尿液的氣化固攝;中極穴為膀胱募穴，是膀胱經(jīng)氣匯聚之處，腑病多取募穴是古今醫(yī)家的共識，故針刺中極穴可以直接調(diào)節(jié)膀胱功能;三陰交穴是肝脾腎三條陰經(jīng)的交會穴，具有溫腎健脾、調(diào)理下焦的作用，臨床與實驗研究[13-14]均表明其可雙向調(diào)節(jié)膀胱的功能。

針灸對骶上SCI后所致的逼尿肌反射亢進型NB臨床療效確切[15]。近年來，針灸治療SCI后NB已從單純的臨床觀察進入到實驗研究階段，其作用機制涉及細(xì)胞凋亡、神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)等多個方面。其機制大致為以下幾點：（1）通過抑制SCI損傷部位軸突及神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，減輕脊髓繼發(fā)性損傷，保護受損神經(jīng)元，最大限度地?fù)尵燃顾璧臍埓婀δ埽纳瓢螂椎纳窠?jīng)支配;（2）通過對膀胱逼尿肌和尿道內(nèi)括約肌的影響，調(diào)整膀胱的貯尿、排尿功能;（3）通過反射性地調(diào)節(jié)交感-副交感神經(jīng)的協(xié)調(diào)作用，從產(chǎn)尿、儲尿、控尿、排尿等各方面調(diào)節(jié);（4）通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的合成和釋放來影響膀胱功能活動[16]。本研究中電針干預(yù)后的膀胱組織中逼尿肌纖維、細(xì)胞的結(jié)構(gòu)破壞較模型組減輕，并且膀胱容量和順應(yīng)性增加，壓力降低，受累膀胱功能得到改善，其作用機制可能是電針干預(yù)促進受損神經(jīng)元與周圍正常神經(jīng)元形成新的突觸聯(lián)系，重建傳導(dǎo)通路，優(yōu)化了膀胱的神經(jīng)支配。

神經(jīng)營養(yǎng)素家族主要包括BDNF、NGF、NT-3等，通過結(jié)合Trk酪氨酸激酶受體或P75神經(jīng)營養(yǎng)素受體發(fā)揮功能，神經(jīng)營養(yǎng)素是神經(jīng)元中重要的調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞存活、分化和維持的因子，作為小分子蛋白分泌到神經(jīng)系統(tǒng)來保持神經(jīng)細(xì)胞存活[17]。NGF與NT-3均由膠質(zhì)細(xì)胞分泌表達(dá)，但對于促進神經(jīng)元的修復(fù)有不同影響。其中，NT-3 可促進突觸前運動神經(jīng)元軸突的生長[18]，調(diào)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞活性，并影響其與運動神經(jīng)元的相互作用[19]，從而促進突觸成熟。NGF與NT-3對雪旺膠質(zhì)細(xì)胞的作用相似，雪旺膠質(zhì)細(xì)胞表面有NGF受體，NGF可促進雪旺膠質(zhì)細(xì)胞增殖，促進突觸成熟[20]。

NGF 是由Rita Levi-Montgalcini在1953 年首先發(fā)現(xiàn)的[21]，是神經(jīng)營養(yǎng)因子的典型代表，TrkA 是其受體[22]，可促進未損傷的神經(jīng)元生芽，重建被破壞的神經(jīng)回路。正常脊髓組織中會有少量NGF的表達(dá)，當(dāng)SCI后，受損局部的NGF的表達(dá)量將增加，刺激誘導(dǎo)軸突再生，促進神經(jīng)通路及抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡等作用[22]，SCI早期神經(jīng)再生活躍，但隨著維持神經(jīng)生長的神經(jīng)絲蛋白減少，神經(jīng)元最終會死亡，因此，為減少神經(jīng)元在受損后發(fā)生繼發(fā)性凋亡，需要提供更多更久的神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)。NGF在體內(nèi)可維持神經(jīng)元的存活，促使軸突延伸，對SCI的神經(jīng)功能恢復(fù)、重建具有重要作用[24-25]。本研究中觀察到模型組NGF的表達(dá)低于正常組與假手術(shù)組，其原因主要考慮兩點：其一是采集樣本時間是在造模后第26天，NGF的表達(dá)經(jīng)歷高峰后已經(jīng)開始下降，此時受損部位發(fā)生了繼發(fā)性損傷;其二是造模方式與損傷節(jié)段的影響，本實驗中考慮到模型的標(biāo)準(zhǔn)性，采用的是完全性脊髓橫斷法造模，而采用打擊或夾持模型的方法則未造成脊髓全橫斷，這對于內(nèi)源性NGF的生成與表達(dá)無疑是更有益的。在本實驗中觀察到電針治療能增加受損脊髓神經(jīng)元中NGF蛋白及NGF mRNA的表達(dá)，促進脊髓側(cè)支的生芽和突觸的重建，這可能是電針治療促進神經(jīng)再生的有效途徑之一[26]。

NT-3是基于NGF和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子同源性而發(fā)現(xiàn)的，屬于在脊髓中作用最強的神經(jīng)營養(yǎng)因子，SCHNELL等[27]研究證明NT-3對軸突再生的促進效果優(yōu)于NGF與BDNF。NT-3的生理作用廣泛，尤其在促進神經(jīng)元生長、分化與成熟及維持神經(jīng)元存活等方面發(fā)揮重要的作用。研究[28]發(fā)現(xiàn)NT-3在促進神經(jīng)干細(xì)胞分化的過程中，更多傾向于分化為神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞，相對而言分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞的較少。研究[29]表明，NT-3對與感覺神經(jīng)元和運動神經(jīng)元都有作用，SCI后當(dāng)天就有NT-3的表達(dá)，第3天達(dá)到高峰后逐漸降低，NT-3參與了SCI后的修復(fù)過程，是脊髓感受傷害性反應(yīng)的內(nèi)源性保護因子，但這種內(nèi)源性的保護作用是有限度且受很多因素影響的。可以促進突觸后NT-3分泌增加的幾種機制有：Ca2+內(nèi)流引起鈣調(diào)蛋白及其蛋白激酶II的激活，胞內(nèi)cAMP/PKA信號通路的激活[30]。前期研究[31-32]表明，電針可以激活上述通路而發(fā)揮效應(yīng)。本研究中，NGF蛋白及其mRNA的表達(dá)量，模型組低于正常組和假手術(shù)組，而模型大鼠NT-3蛋白及mRNA的表達(dá)卻高于正常組與假手術(shù)組，這說明不同類型神經(jīng)營養(yǎng)素在受損脊髓細(xì)胞中表達(dá)的時間與量并不完全一致，神經(jīng)營養(yǎng)素的再受損脊髓中的表達(dá)存在“波峰”，其出現(xiàn)時間與峰高的差異與SCI類型、損傷節(jié)段、干預(yù)因素等均有關(guān)系。NT-3是在受損脊髓組織細(xì)胞中表達(dá)時間較長和表達(dá)量較高的一種神經(jīng)營養(yǎng)素，故很多研究都緊扣如何提高NT-3的表達(dá)來展開，此外NT-3還具有雙向調(diào)節(jié)作用：一方面可以抑制Bax表達(dá)，促進Bcl-2表達(dá)，對SCI后神經(jīng)元凋亡有抑制作用，從而在SCI后發(fā)揮保護作用[33];另一方面可以促進間充質(zhì)干細(xì)胞分泌更多的NGF和BDNF[34]。

本研究從電針上調(diào)骶上SCI后NB大鼠脊髓組織細(xì)胞中神經(jīng)營養(yǎng)素NGF和NT-3蛋白及其mRNA含量、改善膀胱神經(jīng)支配、提高受累膀胱儲尿控尿能力的角度，部分闡述了其對NB的可能效應(yīng)機制，神經(jīng)營養(yǎng)素作用的具體神經(jīng)調(diào)節(jié)機制可進一步研究探討，以期為電針治療骶上SCI后NB的臨床應(yīng)用提供更加明確的依據(jù)。

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