于棟，?？尚?，安家慧，葉洋，李玉峰

(南京農業(yè)大學動物醫(yī)學院/農業(yè)農村部動物細菌學重點實驗室，江蘇 南京 210095)

豬傳染性胸膜肺炎是豬的一種呼吸系統(tǒng)急性接觸性傳染病，臨床癥狀包括高燒、咳嗽和流鼻涕[1]。該病各年齡階段的豬群均易感，發(fā)病率在10%以上，最急性型死亡率可達80%～100%，從急性和慢性感染中康復的豬可以持續(xù)排出病原體而沒有臨床癥狀，因此難以控制和根除[2-4]。自1957年發(fā)現以來，豬傳染性胸膜肺炎對各國生豬產業(yè)造成了巨大的經濟損失[5]。胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)屬于巴氏桿菌科、放線桿菌屬，是一種革蘭陰性短桿狀細菌，是豬傳染性豬胸膜肺炎的重要致病因子[1]。APP共有15種血清型，不同血清型間交叉保護性低[5-6]。APP能夠產生多種毒力因子，包括溶血外毒素(Actinobacilluspleuropneumoniae-RTX-toxins，Apx)、外膜蛋白、脂多糖、轉鐵結合蛋白、莢膜、菌毛等[7]，其中 Apx被認為是APP最重要的毒力因子。目前已經發(fā)現的Apx有ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ[8]，其中ApxⅠ有較強的溶血活性；ApxⅡ溶血活性較弱[9]；ApxⅢ有強細胞毒性，不具有溶血活性[10]；ApxⅣ由所有APP血清型在感染豬體中產生，但在體外培養(yǎng)條件下不產生[2]，由大腸桿菌表達的產物有較弱溶血活性[11]。與此同時，Apx也是APP主要的免疫原，在針對APP的各種疫苗中，使用ApxⅠ、ApxⅡ和ApxⅢ的重組蛋白作為疫苗抗原制備的亞單位疫苗在保護性方面顯示出良好的功效：馬艷芳[12]研究提取ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ毒素，發(fā)現其在豬傳染性胸膜肺炎的免疫保護過程中具有一定作用；周家強[9]將ApxⅡ A蛋白純化后免疫小鼠，三免后發(fā)現其抗體效價明顯提升，并且通過動物試驗證明ApxⅡ A蛋白在一定程度內能夠增強滅活苗的免疫效果；王方昆等[13]研究發(fā)現ApxⅣ N端有良好的免疫原性；萬玉萌等[14]表達了ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和外膜蛋白Omp2，并證明重組蛋白具有良好的免疫反應性。APP血清學診斷方法的建立也常以Apx為抗原：Myunghwan等[2]開發(fā)的ELISA方法可以評估動物體內針對ApxⅠ，ApxⅡ和ApxⅢ每種毒素的特異性抗體水平；李鳳梅等[5]研究發(fā)現以ApxⅣ-ELISA檢測APP具有一定的可行性，且具有特異性良好、準確性較高、重復性較好的特點。

目前，國內相關研究中制備的Apx毒素蛋白大多以包涵體形式存在，免疫原性較差。本研究選擇APP的ApxⅠ、ApxⅢ、ApxⅣ親水區(qū)進行截短表達，以期提高重組蛋白在上清的表達量，為后續(xù)亞單位疫苗的制備以及建立具有較好特異性的ELISA檢測方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒

大腸桿菌DH5α、Rosetta(DE3)，APP血清2型和5型等由本實驗室保存；原核表達載體pColdI、pET-32a購自TaKaRa(大連)生物技術有限公司。

1.2 試劑

T4 DNA連接酶，購于TaKaRa(大連)公司；DNA凝膠回收盒、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、瓊脂糖、小鼠抗6×His組氨酸單克隆抗體(mAb)，購于南京天為公司；DNA Marker DL5000、2× Phanta Mix，購于諾唯贊公司；DNA Marker DL2000，購于擎科生物科技有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG，購于南京生興生物技術有限公司；蛋白分子質量標準品、限制性核酸內切酶XhoⅠ、HindⅢ和SacⅠ，購于賽默飛世爾科技(中國)公司；細菌組DNA提取盒，購于天根公司；質粒提取試劑盒，購自Biomiga；其余試劑為進口/國產分析純。

1.3 截矩基因片段tApxⅠ、tApxⅢ、tApxⅣ的擴增

參照TIANamp Bacteria DNA Kit說明書，取3 mL過夜轉接的新鮮APP 2型和5型菌液提取總DNA。根據GenBank中收錄的APP ApxⅠ、ApxⅢ、ApxⅣ基因序列設計引物，并在ApxⅠ、ApxⅢ、ApxⅣ 3對引物的上、下游分別對應引入XhoⅠ和HindⅢ的2個酶切位點，在ApxⅢ引物的上、下游分別對應引入SacⅠ和XhoⅠ的2個酶切位點。引物合成由英濰捷基公司完成(序列見表1)。

以APP菌液提取的總DNA為模板，用上述引物擴增tApxⅠ、tApxⅢ、tApxⅣ基因。PCR反應體系如下：2×Phanta Mix 12.5 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，DNA模板2.0 μL，補水至25 μL。PCR擴增條件如下：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸2 min，進行35個反應循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.4 原核表達質粒的構建與鑒定

PCR產物經1%瓊脂糖核酸凝膠電泳進行初步鑒定，參照凝膠回收試劑盒說明進行片段回收，將含有酶切位點的目的基因片段和pColdI空表達載體同時進行限制性核酸內切酶雙酶切，上述2種產物分別經10 g/L瓊脂糖凝膠核酸電泳，根據目的片段大小分別回收產物后進行連接，上述連接產物轉化進入克隆感受態(tài)DH5α細胞內，經37 ℃ 搖床200 r/min培養(yǎng)1 h后涂布于LB固體培養(yǎng)基(pColdI為Ampr)37 ℃過夜培養(yǎng)。經PCR鑒定，挑取疑似陽性的單克隆菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基(內含有Ampr)培養(yǎng)12～16 h后提取質粒，對重組質粒進行雙酶切鑒定，鑒定結果為陽性后，送至通用公司測序，將所得的序列提交到NCBI網站上GenBank進行序列比對，確認正確的重組質粒命名為pColdI-tApxⅠ、pColdI-tApxⅢ、pColdI-tApxⅣ。

表1 引物設計

1.5 重組質粒的誘導表達及蛋白可溶性分析

將鑒定正確的重組質粒轉化進入Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞中，涂布于LB固體培養(yǎng)基(pColdI、pET-32a為Ampr)置37 ℃過夜培養(yǎng)。從LB固體培養(yǎng)基上挑取陽轉單克隆菌落，接種至LB液體培養(yǎng)基(pColdI、pET-32a為Ampr)，常規(guī)培養(yǎng)至菌液OD600范圍為0.4～0.6，加入IPTG使終濃度達到1 mmol·L-1，pColdI-tApxⅠ、pColdI-tApxⅢ、pColdI-tApxⅣ以160 r/min 15 ℃的條件誘導24 h后收集1 mL菌液，pET-32a- tApxⅠ以160 r/min 30 ℃的條件誘導8 h后收集1 mL菌液，同時收集誘導的pColdI、pET-32a空載體菌液做陰性對照。收集的菌液經pH=7.4的PBS緩沖液洗滌2次后，以80 μL PBS緩沖液重懸并加入20 μL 5×SDS Loading buffer振蕩混勻瞬時離心煮沸5～10 min處理，經SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍染色分析。獲得誘導后的重組蛋白，收集誘導表達的全菌以pH=7.4的PBS緩沖液洗滌2次并重懸，超聲波破碎裂解細胞，分別對上清和沉淀進行收集及處理，經12.5%凝膠SDS-PAGE檢測，判斷表達產物存在形式。

1.6 重組蛋白的Western blot鑒定及反應原性分析

將重組蛋白rtApxⅠ、rtApxⅢ、rtApxⅣ的表達產物處理后的上清經SDS-PAGE分離，將電泳后產物通過半干法轉印至硝酸纖維素膜，將6×His單抗/豬多抗作為一抗，HRP-羊抗鼠/抗豬IgG作為二抗，進行Western blot試驗。

1.7 重組蛋白的純化

將100 mL經IPTG誘導的菌液用PBS緩沖液洗滌2次后以結合緩沖液重懸進行超聲裂解，13 000 r/min離心10 min后取上清用0.22 μm濾器過濾后作為蛋白樣品。參照Ni-NTA說明書，先將10倍柱體積結合緩沖液通過鎳柱，然后加入蛋白樣品，之后用洗滌緩沖液洗滌樹脂，至流穿液中溶質含量保持穩(wěn)定，最后以5倍柱體積洗脫緩沖液洗脫樹脂，收集純化樣品。

2 結果與分析

2.1 重組質粒的PCR及雙酶切鑒定

挑取抗性平板上的單克隆菌落培養(yǎng)提取質粒，進行PCR擴增及核酸凝膠電泳分別出現大小為1 713、1 350、1 467 bp左右的條帶(圖1A)，與預期大小一致。重組質粒pColdI-tApxⅢ經SacⅠ和XhoⅠ雙酶切，得到1 350 bp的基因片段和4 400 bp左右的載體片段；pColdI-tApxⅠ、pColdI-tApxⅣ經HindⅢ和XhoⅠ雙酶切分別獲得1 713、1 467 bp左右的基因片段及4 400 bp的載體片段(圖1B)。測序結果正確，表明已成功構建了重組表達質粒pColdI-tApxⅠ、pColdI-tApxⅢ、pColdI-tApxⅣ。

M1.DNA分子質量標準DL2000；M2.DNA分子質量標準DL5000；1.tApxⅠ基因；2.tApxⅢ基因；3.tApxⅣ基因；4.pColdI-tApxⅠ雙酶切；5.pColdI-tApxⅢ雙酶切；6.pColdI-tApxⅣ雙酶切

2.2 重組蛋白的誘導表達

將重組質粒pColdI-tApxⅠ、pColdI-tApxⅢ、pColdI-tApxⅣ轉化至Rosetta(DE3)誘導表達，進行SDS-PAGE分析，在63、50和54 kDa左右的位置出現目的條帶，與預期相符。確定3種重組蛋白表達以后，將誘導后的細菌全菌經過洗滌，超聲波破碎裂解離心，對經過離心的上清液進行凝膠SDS-PAGE分析。pColdI-tApxⅠ、pColdI-tApxⅢ、pColdI-tApxⅣ在上清均表達(圖2A、2B)。

M.預染蛋白分子質量標準；1.Rosetta/pColdI-tApxⅠ誘導后全菌；2.Rosetta/pColdI-tApxⅠ超聲破碎后上清；3.Rosetta/pColdI-tApxⅠ超聲破碎后沉淀；4.Rosetta/pColdI-tApxⅢ誘導后全菌；5.Rosetta/pColdI-tApxⅢ超聲破碎后上清；6.Rosetta/pColdI-tApxⅢ超聲破碎后沉淀；7.Rosetta/pColdI-tApxⅣ誘導后全菌；8.Rosetta/pColdI-tApxⅣ超聲破碎后上清；9.Rosetta/pColdI-tApxⅣ超聲破碎后沉淀

2.3 重組蛋白的Western blot鑒定

對含有重組表達質粒pColdI-tApxⅠ、pColdI-tApxⅢ、pColdI-tApxⅣ的重組大腸桿菌Rosetta誘導表達進行可溶性分析，發(fā)現目的蛋白在上清與包涵體中均存在。誘導后的上清液加入上樣緩沖液煮沸處理，經SDS-PAGE分析，以鼠抗His-IgG為一抗，HRP-羊抗鼠IgG為二抗進行Western blot分析，在63、50和54 kDa相應位置出現特異性抗原抗體結合帶(圖3A)。同時，以陽性豬血清作為一抗進行孵育，然后以酶標豬二抗進行孵育后染色，結果證明表達的可溶性重組蛋白rtApxⅠ、rtApxⅢ、rtApxⅣ均與APP天然抗體發(fā)生特異性反應(圖3B、3C)。

M.預染蛋白分子質量標準；1.超聲破碎后Rosetta/pColdI-tApxⅠ上清；2.超聲破碎后Rosetta/pColdI-tApxⅢ上清；3.超聲破碎后Rosetta/pColdI-tApxⅣ上清；4.超聲破碎后Rosetta/pColdI-tApxⅠ上清；5.超聲破碎后Rosetta/pColdI-tApxⅢ上清；6.超聲破碎后Rosetta/pColdI-tApxⅣ上清

2.4 重組表達蛋白的純化

SDS-PAGE結果表明，使用Ni-NTA親和層析純化，在0 mmol/L結合緩沖液、60 mmol/L 洗滌緩沖液的條件下能夠有效純化ApxⅠ(圖4A)；在30 mmol/L 結合緩沖液、100 mmol/L洗滌緩沖液的條件下能夠有效純化ApxⅢ(圖4B)；在20 mmol/L 結合緩沖液、60 mmol/L洗滌緩沖液的條件下能夠有效純化Ⅳ(圖4C)。

A.重組蛋白rtApxⅠ純化的SDS-PAGE分析：M.預染蛋白分子質量標準；1.超聲破碎后上清；2～3.流穿液；4～5.洗滌緩沖液；6～8.純化后蛋白

3 討論

由于包涵體需要經過復雜的變性溶解和復性折疊過程，導致目的蛋白復性率低、損失量大，而可溶性蛋白表達則可以很好地避免這一問題。為了實現目的蛋白的可溶性表達，本試驗中對ApxⅠ、ApxⅢ、ApxⅣ的表達曾嘗試使用pColdI載體、pET-32a載體，更換宿主菌Rosetta，使用4種帶有伴侶蛋白的BL21質粒(PG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2)，并且對誘導溫度、轉速、時長、IPTG濃度以及誘導前的菌液濃度等條件進行優(yōu)化，最終實現了pColdI-tApxⅠ、pColdI-tApxⅢ、pColdI-tApxⅣ的可溶性表達。pET-32a載體雖然帶有融合蛋白有利于實現可溶性表達，但重組蛋白用于后續(xù)試驗時需去除載體的融合蛋白，且用pET-32a載體的表達效果不如pColdI載體，故選擇pColdI載體進行蛋白的可溶性表達。重組蛋白帶有His標簽，可使用Ni-NTA進行純化，通過優(yōu)化結合液、洗滌液、洗脫液中的咪唑濃度，從而獲得了純化效果較好的rtApxⅠ、rtApxⅢ、rtApxⅣ重組蛋白。

目前，我國主要通過接種全菌滅活疫苗來預防豬傳染性胸膜肺炎，但由于APP血清型較多，不同血清型之間交叉保護性低，常規(guī)疫苗的使用已經無法達到有效預防該疾病的目的。Park等[15]研究曾表明使用重組Apx毒素的抗APP亞單位疫苗對不同血清型具有良好的交叉保護作用，因此當前許多可用的疫苗都將多個血清型共有的Apx作為其關鍵抗原[16]。劉建杰等[17]利用大腸桿菌表達APP的分泌毒素ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ，提取表達產物包涵體，再加入APP 7型菌制成亞單位菌苗，結果發(fā)現用APP 1型和APP 7型菌株進行攻毒后其保護力分別為83.3%和91.7%。邵美麗等[18]用重組蛋白ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ、Omp組合作為免疫原免疫小鼠，結果發(fā)現，接種4組重組蛋白小鼠的特異性抗體水平較高，且該組用APP 1型菌和APP 2型菌進行攻毒后的保護率也優(yōu)于其他組。Park等[15]研究中開發(fā)的由ApxⅠA和ApxⅡA片段組成的二價疫苗顯示出針對APP血清1型、2型菌株的交叉保護作用。本研究在實驗室可溶性表達蛋白的基礎上，成功對tApxⅠ、tApxⅢ進行了可溶性表達，期望這2種重組蛋白可以共同作為有效抗原成分，從而制備出具有較好免疫保護效果的亞單位疫苗。

ELISA檢測方法操作簡便、快速，且具有良好的敏感性，是常用的血清學診斷方法。ApxⅣ只在動物體內表達且僅由APP產生，根據這一特點建立的ApxⅣ-ELISA可有效區(qū)分APP滅活疫苗或亞單位疫苗免疫豬與自然感染豬[19]，并能與其他的豬呼吸道疾病病原如豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌等進行鑒別診斷[13,19]。González 等[20]利用ELISA方法檢測了在試驗條件下接種APP的豬的血清和口腔液中的ApxⅣ特異性抗體，結果發(fā)現接種APP血清1型和7型的豬的ApxⅣ血清和口腔液的抗體反應與LPS抗體反應模式相近。市場上在售的APP-ELISA檢測試劑盒中，國外的試劑盒價格昂貴，國內的試劑盒采用的是間接ELISA檢測方法，特異性較差。本研究將ApxⅣ表達在上清，后期可以制備ApxⅣ特異性單克隆抗體并將其應用于高效、靈敏地阻斷ELISA方法的建立，以期研制出成本低廉且具有較好特異性的ApxⅣ-ELISA診斷試劑盒。

綜上所述，本研究在實驗室前期對ApxⅡ和Omp2蛋白研究的基礎上，通過條件優(yōu)化使tApxⅠ、tApxⅢ、rtApxⅣ重組蛋白表達在上清并成功純化，為研制具有較好交叉保護性的亞單位疫苗以及建立有效區(qū)分APP滅活疫苗或亞單位疫苗免疫豬與自然感染豬的ELISA檢測方法奠定了物質基礎。