張 笑，李志強，岳 芹，鄒艷敏，歐陽臻，韓邦興，魏 淵* *

(1. 江蘇大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 安徽省中藥資源保護與持續(xù)利用工程實驗室，安徽 六安 237012； 3. 皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012； 4. 皖西學(xué)院 金融與數(shù)學(xué)學(xué)院，安徽 六安 237012 )

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)俗稱米斛，是蘭科石斛屬的草本植物，主產(chǎn)于大別山區(qū)的安徽省霍山等地區(qū)?；羯绞闹仓臧?，長3～9 cm，莖直立由下向上逐漸變細(xì)，呈圓錐狀，形似米粒，花呈淡黃綠色，具有獨特的地理分布、形態(tài)特征、遺傳結(jié)構(gòu)及藥理活性[1-2]?！侗静菡x》中記載“若老人虛人，胃液不足，而不宜大寒者，則霍山石斛為佳。”[3]?，F(xiàn)代研究表明，霍山石斛含有石斛多糖、生物堿、酚酸、微量元素、氨基酸等多種藥用成分[4-7]，具有抗氧化、抗炎、抗肝損傷、抗腫瘤及抗疲勞等藥理作用[8-12]。

霍山石斛具有良好的抗炎作用，有研究報道以脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞為炎癥模型，觀察霍山石斛多糖的抗炎作用，發(fā)現(xiàn)霍山石斛多糖能抑制炎癥細(xì)胞炎癥因子的表達，并且半仿生提取方法得到的霍山石斛多糖抗炎作用更佳[13]。霍山石斛的抗炎作用與TNF-α、IL-1、IL-2、IL-1b和IFN-γ等炎癥因子的降低相關(guān)[14-16]，且與抑制NF-κB、MAPK及Akt通路的活化有關(guān)[17]。

霍山石斛也具有一定的抗癌活性，可抑制胃癌細(xì)胞的增殖，其機制與c-myc基因和p53基因的表達有關(guān)[18-19]。同時，霍山石斛能抑制荷宮頸癌小鼠腫瘤組織的生長，抗癌機制與細(xì)胞因子IFN-γ和CD8 +T細(xì)胞的活性相關(guān)[20]。鮑麗娟等[21]研究發(fā)現(xiàn)霍山石斛水提物對人宮頸癌HelaS3細(xì)胞和肝癌HepG2細(xì)胞均有不同度的抑制作用。

由于野生霍山石斛的生長條件苛刻，且對濕度和光照的要求很高，自然繁殖率低，加上過度采摘，導(dǎo)致野生霍山石斛瀕臨滅絕[22]。目前人工栽培霍山石斛已逐漸代替野生霍山石斛，其采收期多為每年的秋冬季。然而鮮有不同生長年限的霍山石斛成分含量與藥效的差異報道，開展霍山石斛采收期相關(guān)研究可保障藥材質(zhì)量，促進霍山石斛產(chǎn)業(yè)化發(fā)展?！吨袊幍洹?020年版對霍山石斛采收期做出規(guī)定，為每年的11月至翌年的3月采收，但并未對采收年限做出要求。中藥材的化學(xué)成分復(fù)雜，中藥產(chǎn)生的療效并非某一種成分的單獨作用效果，而是多組分、多靶點之間共同作用，因此藥材的采收期將直接影響藥材的藥效。多糖為石斛類藥材含量較多的成分之一，其合成過程受到多種酶的影響，例如磷酸葡糖異構(gòu)酶、GDP-葡萄糖焦磷酸化酶、蔗糖合成酶和淀粉合成酶等[23-24]，多糖的積累與種質(zhì)、產(chǎn)地、生理年齡等因素有關(guān)[25-27]。次生代謝產(chǎn)物的合成途徑多樣，遺傳、環(huán)境以及激素調(diào)控等因素都可能影響其含量，次生代謝產(chǎn)物的積累與藥材質(zhì)量密切相關(guān)，是保證藥材安全、有效、穩(wěn)定的基礎(chǔ)[28-30]。

通過研究不同生長年限藥材的物質(zhì)成分含量，可以對不同生長年限藥材整體化學(xué)成分進行分析比較，結(jié)合藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及整體藥用價值，可為藥材的采收期提供更明確的指導(dǎo)。已有不少關(guān)于生長年限影響藥材藥效成分的研究。彭焱等[31]研究不同生長年限(2年和3年)的白及5種藥效成分含量差異，綜合其藥用部位(塊莖)產(chǎn)量與藥效成分含量考慮,建議白及采收以其生長年限3年及以上為宜。夏琴等[32]發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地、不同商品規(guī)格及生長年限豬苓藥材中麥角甾醇及多糖的含量存在較大差異，麥角甾醇以四年生豬苓樣品含量最高。薛雪等[33]發(fā)現(xiàn)不同生長方式及年限的防風(fēng)飲片外觀性狀、內(nèi)在質(zhì)量和療效有明顯差異，并呈現(xiàn)野生防風(fēng)優(yōu)于多年生栽培防風(fēng)優(yōu)于一年生栽培防風(fēng)的變化規(guī)律。

研究不同生長年限霍山石斛活性成分多糖、黃酮、生物堿和石斛酚的含量差異，通過二甲苯致小鼠耳腫脹試驗探究不同生長年限霍山石斛的抗炎作用。還比較了不同生長年限霍山石斛對HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用，為霍山石斛采收年限提供更充足的依據(jù)，并為霍山石斛抗炎藥效的探究及在腫瘤防治中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 試驗材料

1.1 試驗動物及細(xì)胞

試驗選取健康的八周齡SPF級C57BL/6小鼠，80只，雄性，體重20±2 g，購自江蘇大學(xué)試驗動物中心(動物許可證號：SCXK(蘇)2018-0053)。12 h明暗交替周期飼養(yǎng)，自由進食和飲水，購買后正常適應(yīng)性飼養(yǎng)一周用于試驗。

試驗細(xì)胞為人宮頸癌HeLa細(xì)胞(批號：CBP60232)，購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.2 藥物與試劑

霍山石斛(D.huoshanense)由皖西學(xué)院韓邦興教授提供和鑒定。

蘆丁(北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司，批號：180324)；石斛酚(北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司，批號：180924)；石斛堿(北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司，批號181226)；無水葡萄糖(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20180620)；胎牛血清(美國Gibco公司)；胰酶消化液(碧云天生物技術(shù)公司)；青霉素、鏈霉素(美國Sigma公司)；5-FU(上海阿達瑪斯試劑有限公司)；CCK-8試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)；DMEM 培養(yǎng)基(以色列Biological Industries公司)；二甲苯(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；地塞米松(浙江仙琚制藥有限公司)。

1.3 主要儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，Agilent Eclipse plus C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm )色譜柱(美國Agilent公司)；Spectra Max 190型酶標(biāo)儀(美國MD公司)；SK-1快速混勻器(江蘇中大儀器廠)；TE601-L電子天平(北京Sartorius儀器系統(tǒng)有限公司)；Pic017臺式離心機(美國Thermo Fisher公司)；Model 754型紫外分光光度計(上?，F(xiàn)科儀器有限公司)；3111 CO2孵箱(美國Thermo公司)；1300 SERIES A2超凈工作臺(美國Thermo公司)；TS110倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；BSA1245電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；7mm耳腫脹打孔器(上海泰坦科技股份有限公司)；BuchiR-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；SHB-III循環(huán)水多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

2 方 法

2.1 霍山石斛榨汁液及水提物的提取

霍山石斛榨汁液的制備：將石斛新鮮莖的雜質(zhì)去除，洗凈，剪成小段，稱取10 g放入榨汁機中榨汁，濾布過濾，定容至100 mL，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

霍山石斛水提物制備方法為：精密稱取不同生長年限霍山石斛粉末各5 g，加水200 mL，加熱回流2 h，趁熱過濾，濃縮后凍干得不同生長年限霍山石斛水提物。

2.2 不同生長年限霍山石斛抗炎作用

2.2.1 分組及給藥

將 C57BL/6小鼠隨機分為8組，每組10只，分別為空白對照組、陽性組、一年生霍山石斛低劑量組(生藥1.25 g·kg-1，參照《中國藥典》石斛用量)、一年生霍山石斛高劑量組(生藥7.5 g·kg-1)、二年生霍山石斛低劑量組(含生藥1.25 g·kg-1)、二年生霍山石斛高劑量組(生藥7.5 g·kg-1)、三年生霍山石斛低劑量組(生藥1.25 g·kg-1)和三年生霍山石斛高劑量組(生藥7.5 g·kg-1)。各給藥組連續(xù)灌胃給藥7 d，每24 h灌胃給藥，空白對照組給予等量的生理鹽水，陽性對照組給予5 mg·kg-1地塞米松。

2.2.2 二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳腫脹

末次給藥1 h后，用移液槍在小鼠右耳的耳中部兩側(cè)均勻滴30 μL二甲苯致炎，左耳不做處理作為空白對照，1 h后將小鼠CO2窒息法處死，用打孔器將小鼠兩耳重疊打孔，精密稱量，計算腫脹度和腫脹抑制率。

腫脹度=右耳重量-左耳重量

2.3 不同生長年限霍山石斛抗腫瘤作用

2.3.1 試驗細(xì)胞分組

試驗分為陽性對照組(5-FU，50 μg·mL-1)、空白對照組、濃度分別為(2、4、6、8、10 mg·mL-1)的一年生霍山石斛水提物組、濃度分別為(2、4、6、8、10 mg·mL-1)的二年生霍山石斛水提物組、濃度分別為(2、4、6、8、10 mg·mL-1)的三年生霍山石斛水提物組。

2.3.2 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)

2.3.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇

快速從液氮罐取出細(xì)胞凍存管，37℃水浴快速解凍，加到10 mL無菌離心管中并加入6 mL含10%血清的DMEM培養(yǎng)液，輕吹混勻，1200 r·min-1離心5 min，棄上清液，加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，在CO2培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2)中進行培養(yǎng)。

2.3.2.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng)

待細(xì)胞生長至80%左右，吸除舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗2次，加適量胰蛋白酶消化液消化2 min，加入含10%血清的培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞吹打分散，1000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入適量含10%血清的培養(yǎng)基，置37℃，5% CO2孵育箱中培養(yǎng)。

2.3.3 CCK-8法檢測細(xì)胞活性

取對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，用胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度并接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(5×104/mL，每孔100 μL)，在CO2孵育箱(37℃，5% CO2)中進行培養(yǎng)。分別加入不同濃度的不同生長年限霍山石斛水提物，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后棄上清，每孔加入10 μL CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)3 h后于450 nm處測定OD值，計算細(xì)胞增殖抑制率。

細(xì)胞增殖抑制率(%)=(A0-A1)/A0

注：A0為陰性對照組，A1為給藥組OD值。

2.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6.0軟件進行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，應(yīng)用SPSS 22.0軟件進行多成分配對檢驗等處理，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01表示差異有重要統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 不同生長年限霍山石斛主要成分含量

課題組前期測定不同生長年限霍山石斛多糖、總黃酮、總生物堿和石斛酚含量如表1所示[34]。不同生長年數(shù)霍山石斛的4種化學(xué)成分含量差異較大，其中霍山石斛黃酮和生物堿含量隨年份增加而增加，3年生含量最高，1年生含量最少。而2年生多糖和石斛酚含量最高，3年生含量最低。

表1 不同生長年數(shù)霍山石斛4種成分平均含量

3.2 不同生長年限霍山石斛對HeLa細(xì)胞增殖的影響

與空白組相比，不同生長年限霍山石斛水提物作用于HeLa細(xì)胞24 h后，質(zhì)量濃度在2-10 mg/mL范圍內(nèi)均可抑制HeLa細(xì)胞活力，且隨著濃度的升高，細(xì)胞增殖抑制作用增強。同一濃度下，3年生霍山石斛水提物對HeLa細(xì)胞增殖抑制率均高于2年生霍山石斛，1年生霍山石斛對HeLa細(xì)胞增殖抑制率最低，如圖1。

圖1 不同生長年限霍山石斛水提物對HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用Fig. 1 Proliferation of HeLa cells inhibited by water extracts of D. huoshanense of different growth years

3.3 不同生長年限霍山石斛抗炎作用比較

與模型組相比較，不同生長年限霍山石斛低高劑量組均能降低二甲苯所致小鼠的耳腫脹度(P< 0.01)。1年生霍山石斛低高劑量組、2年生低劑量組和3年生低劑量組耳腫脹度抑制均高于地塞米松組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。2年生高劑量組和3年生高劑量組耳腫脹度與地塞米松組沒有顯著性差異(P> 0.05)，表明2年生和3年生高劑量組抗炎效果與陽性組相近。各給藥組中，2年生高劑量組小鼠耳腫脹抑制率最高，達到58.80%，3年生高劑量組耳腫脹抑制率也較高，達到56.93%。結(jié)果見表2。

表2 不同生長年限霍山石斛對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

3.4 不同生長年限霍山石斛抗腫瘤藥性配對t檢驗

為判斷不同生長年限石斛治療腫瘤是否具有顯著差異，分別提取了1年、2年和3年生的霍山石斛藥性，在不同濃度下分別利用SPSS軟件對其進行配對樣本t檢驗，表3給出檢驗結(jié)果，結(jié)果顯示1年期和3年期，以及2年期和3年期配對檢驗的P值都小于0.05，并且隨著濃度增大1年生和2年生之間也呈現(xiàn)顯著性差異，這充分說明選擇不同年份的石斛治療腫瘤具有重要意義。

表3 不同生長年限霍山石斛抗腫瘤藥性配對t檢驗

4 討 論

本試驗研究了不同生長年限霍山石斛活性成分多糖、黃酮、生物堿和石斛酚的含量差異以及不同生長年限霍山石斛抗炎、抗腫瘤作用差異。研究發(fā)現(xiàn)，不同生長年限霍山石斛4種主要成分差異顯著，各成分含量與生長年限并不完全成線性增長關(guān)系。黃酮和生物堿含量隨著生長年限增加而增加，3年生最高，1年生最低，而2年生多糖和石斛酚含量最高，3年生含量最低。本試驗所得2年生霍山石斛多糖含量最高，鐵皮石斛[35]、疊鞘石斛[36]的多糖含量也是2年生最高，但金釵石斛[37]的多糖含量卻是1年生最高。由此可見，不同品種石斛多糖含量與生長年限的變化規(guī)律并不一致，多糖的合成受多種因素的影響，霍山石斛不同生長發(fā)育階段多糖含量產(chǎn)生差異有關(guān)的因素仍有待進一步研究。

不同生長年限霍山石斛對二甲苯致小鼠耳腫脹模型的抗炎作用的試驗結(jié)果表明，不同生長年限的霍山石斛均具有較好的抗炎作用，2年生霍山石斛的抗炎作用最佳。4種成分含量測定結(jié)果顯示2年生霍山石斛多糖和石斛酚含量明顯高于3年生和1年生，有研究報道，霍山石斛多糖和石斛酚具有抗炎活性[38-41]，由此推測不同生長年限霍山石斛抗炎藥效的不同主要與多糖和石斛酚有關(guān)。

不同生長年限霍山石斛對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用的試驗結(jié)果顯示，3年生霍山石斛對HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用最強。4種成分含量測定中，3年生霍山石斛黃酮和生物堿含量明顯高于其他年限?；羯绞飰A類具備養(yǎng)胃清熱[42]、降低血壓和心率[43]和抗氧化活性[44]。黃酮類物質(zhì)具有抑制肺癌細(xì)胞[45]、卵巢癌細(xì)胞[46]遷移和侵襲、保肝作用[47]。因此，可推測不同生長年限霍山石斛抗腫瘤作用差異主要與黃酮類物質(zhì)有關(guān)，是否與生物堿有關(guān)有待進一步研究。

綜上所述，本試驗通過研究不同生長年限霍山石斛4種活性成分多糖、黃酮、生物堿和石斛酚的含量差異以及不同生長年限霍山石斛抗炎、抗腫瘤作用差異。結(jié)果顯示，2年生霍山石斛的抗炎作用最佳，3年生霍山石斛對HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用最強，霍山石斛抗炎藥效可能與多糖和石斛酚有關(guān)，霍山石斛抗腫瘤作用可能與黃酮有關(guān)。本研究為霍山石斛的合理選擇采收期和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了新的參考依據(jù)。