范 祺，張 明，張博華，王崇隊，楊立風，孟曉峰，馬 超

（中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，山東濟南 250014）

靈芝孢子油是從靈芝孢子中提取的脂質(zhì)活性物質(zhì)，主要化學成分為不飽和脂肪酸、靈芝三萜類、靈芝酸、靈芝多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸等，有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力、保護神經(jīng)系統(tǒng)、降血脂、防治白血病、保肝護肝等活性，具有很高的藥用價值[1-2]。雖然靈芝孢子油中不飽和脂肪酸含量高，但在自然環(huán)境下極易被氧化。受光照、溫度、氧氣等因素的影響，靈芝孢子油中的活性物質(zhì)被氧化后，會產(chǎn)生有害物質(zhì)，嚴重降低靈芝孢子油的保健功效[3-4]。

乳狀液體系在包埋、保護、運載、成本和生物相容度方面具有獨特的優(yōu)勢[5]，如將不飽和脂肪酸作為油相，既能提高乳狀液的營養(yǎng)價值，也能提高不飽和脂肪酸的抗氧化性[6]。大豆分離蛋白是一種良好的乳化劑，具有親水親油平衡特性，在溶液中可迅速分散在油水界面上，通過結(jié)構(gòu)變化重新排布，形成凝膠化界面層保持乳液穩(wěn)定[7]。大豆分離蛋白制備的乳狀液可以有效包埋DHA、魚油、肉桂精油等[8-10]。大豆異黃酮、茶多酚、抗壞血酸的抗氧化作用可應用于肉制品加工、油脂儲藏及焙烤食品、乳制品、油炸食品的制作，也可用于各種飲料的配制，添加了抗氧化劑的乳狀液具有良好的穩(wěn)定性[11]。

本文利用大豆分離蛋白的乳化特性構(gòu)建水包油型乳狀液，將靈芝孢子油作為油相包埋在內(nèi)部，研究大豆分離蛋白和油濃度對乳狀液體系穩(wěn)定性的影響；同時添加大豆異黃酮、茶多酚和抗壞血酸等幾種常用的抗氧化劑，通過儲藏試驗，以過氧化值為指標，研究乳狀液的抗氧化穩(wěn)定性，以期獲得穩(wěn)定性強、抗氧化效果好的大豆分離蛋白-靈芝孢子油乳狀液體系，為靈芝孢子油在食品保健領(lǐng)域的應用及液體口服類產(chǎn)品的開發(fā)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白（純度＞90%），索萊寶試劑公司；靈芝孢子油，淺黃色液體，CO2超臨界萃取所得，購于冠縣合作社；大豆異黃酮、兒茶素、抗壞血酸（純度均≥98%），購于阿拉丁試劑公司；無水乙醇、十二烷基硫酸鈉、甲醇、鹽酸、氫氧化鈉等試劑，均為分析純，購于上海生工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AH 2100 型高壓均質(zhì)機，美國安拓思有限公司；高速剪切乳化均質(zhì)儀，德國艾卡有限公司；UV1000 紫外-可見分光光度計，上海天美科學儀器有限公司；NanoBrook Omni 粒徑分析儀，配備Zeta 電位測量選件，美國布魯克海文儀器公司；ME104 電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；BSC-150 恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳狀液的制備

將大豆分離蛋白溶解于水中，室溫下緩慢攪拌1 h使蛋白質(zhì)充分溶解，將pH 值調(diào)至7.0，配制質(zhì)量分數(shù)4%（g/g，下同）的大豆分離蛋白母液，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。將大豆分離蛋白母液與靈芝孢子油按一定比例混合，并加入一定質(zhì)量的抗氧化劑（大豆異黃酮、茶多酚、抗壞血酸），使體系質(zhì)量達到100 g。通過高速剪切乳化均質(zhì)儀以10 000 r/min 的轉(zhuǎn)速剪切1 min 制成粗乳液，再用高壓均質(zhì)機在500 bar、4 ℃條件下均質(zhì)3 次制備乳狀液。

1.3.2 大豆分離蛋白濃度、油濃度對乳狀液性質(zhì)的影響

油濃度為0.5%，大豆分離蛋白濃度設(shè)置為0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、2.0%，測定乳狀液的粒徑分布、ζ-電位、離心穩(wěn)定性，考察蛋白濃度對乳狀液的影響。

大豆分離蛋白濃度為0.5%，油濃度設(shè)置為0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、2.0%，測定乳狀液的粒徑分布、ζ-電位、離心穩(wěn)定性，考察油濃度對乳狀液的影響。所有樣品均進行3 次重復。

1.3.3 乳狀液儲藏過程中的穩(wěn)定性

將制備好的乳狀液（油濃度為0.5%、大豆分離蛋白濃度為0.5%）置于恒溫培養(yǎng)箱中（溫度設(shè)置為25 ℃）儲藏10 d，并在第1、2、5、7、10 天測定乳狀液的粒徑、ζ-電位和過氧化值變化。

1.3.4 乳狀液的抗氧化穩(wěn)定性

對照組為靈芝孢子油加入水中，與水混合，最終油濃度為0.5%。將添加了0.1%質(zhì)量濃度的抗氧化劑的乳狀液和對照組放置于恒溫培養(yǎng)箱中（溫度設(shè)置為25 ℃）儲藏10 d，并分別在第1、2、5、7、10 天測定過氧化值。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 粒徑和ζ-電位的測定

采用動態(tài)光散射法（DLS）用于大豆分離蛋白-靈芝孢子油乳狀液的表征。取20 μL 乳狀液樣品，用水溶液稀釋100 倍。在25 ℃條件下，激光衍射角為173°、折射指數(shù)為1.450，測定樣品的粒徑分布及ζ-電位。

1.4.2 離心穩(wěn)定性的測定

在2 mL 離心管中準確加入2 mL 乳狀液，800 r/min離心10 min[12]，在距離心管底部1 cm 處取樣30 μL，加入5 mL、0.1%十二烷基硫酸鈉溶液，混勻后在500 nm 下測定吸光度，每個樣品重復測定3 次，結(jié)果取平均值。乳狀液穩(wěn)定系數(shù)采用式（1）進行計算。

式中，A0為離心前乳狀液的吸光度；At為離心后乳狀液的吸光度。

1.4.3 過氧化值測定

不飽和脂肪酸在空氣中易與氧氣反應而酸敗，氧化過程中活性氧的含量（即過氧化值，用碘的毫克當量表示，單位為mmol/kg）能夠反映油脂和脂肪酸的氧化程度[13]。按《GB 5009.227—2016 食品中過氧化值的測定》測定樣品的過氧化值[14]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用Origin 9.0 軟件繪圖，采用SPSS 19.0處理軟件中T-test 方法進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白和油濃度對乳狀液粒徑的影響

2.1.1 蛋白濃度對乳狀液粒徑的影響

不同大豆分離蛋白濃度下的乳狀液粒徑分布如圖1所示。由圖可知，所有的乳狀液呈現(xiàn)雙峰分布，第一個峰代表的是乳狀液中游離蛋白的粒徑，第二個峰為乳狀液顆粒分布[15]。當大豆分離蛋白濃度為0.1%時，乳狀液的兩個峰分別在272 nm 和2 080 nm 處；當大豆分離蛋白濃度增加時，乳狀液粒徑變小，說明乳狀液穩(wěn)定性有所改善。如大豆分離蛋白濃度為0.2%時，乳狀液兩個峰分別為200 nm 和800 nm；當大豆分離蛋白濃度為0.5%時，乳狀液的粒徑達到最小值，分別為160 nm 和695 nm。繼續(xù)增大大豆分離蛋白濃度，乳狀液的粒徑變大，這可能是因為大豆分離蛋白在水中的溶解度有限，濃度過高，蛋白之間相互聚集，導致乳狀液粒徑變大。

圖1 不同蛋白濃度下乳狀液的粒徑分布Fig.1 Size distribution of emulsions with different protein concentrations

2.1.2 油濃度對乳狀液粒徑的影響

不同油濃度條件下的乳狀液粒徑分布如圖2（見下頁）所示。由圖可知，所有的乳狀液均呈現(xiàn)雙峰分布，隨著油濃度的增加，乳狀液粒徑逐漸增大；當油濃度為0.1%時，粒徑最小，兩個峰分別為120 nm 和600 nm。油濃度為0.2%、0.5%和1.0%時，乳狀液粒徑小幅增加。當乳狀液中油濃度為2.0%時，乳狀液粒徑分布明顯變大，說明油濃度增加，大豆分離蛋白的包埋能力有限，顆粒之間容易發(fā)生絮集，導致粒徑變大。

圖2 不同油濃度條件下乳狀液的粒徑分布Fig.2 Size distribution of emulsions with different oil concentrations

2.2 蛋白和油濃度對乳狀液ζ-電位的影響

ζ-電位是用來表征乳狀液穩(wěn)定性的重要指標。大豆分離蛋白的等電點為4.5～4.6，所有乳狀液的電位在pH為7 的條件下都是負值[16]。在圖3 中，0.1%大豆分離蛋白的乳狀液電位絕對值為32.15 mV，隨著蛋白濃度的進一步提高，電位一直增大。大豆蛋白濃度超過1.0%之后，ζ-電位絕對值下降明顯。當?shù)鞍诐舛葹?.0%時，為59.29mV。

圖3 不同蛋白濃度下乳狀液的ζ-電位Fig.3 ζ-potential of emulsions with different protein concentrations

圖4 為不同油濃度下乳狀液的ζ-電位，當油濃度為0.1%時，ζ-電位絕對值為75.15 mV。當油濃度提高到1%時，乳狀液的ζ-電位絕對值明顯變小，為48.2 mV；當油濃度為2.0%時，ζ-電位絕對值進一步下降。當粒子的ζ-電位絕對值大于30 mV 時，通常被認為是穩(wěn)定的[17]。在乳狀液中存在空間排阻效應，粒子的ζ-電位絕對值大于20 mV 時，也可能使粒子穩(wěn)定分散于溶液中，當油濃度過高時，乳狀液乳化能力有限，不能阻止粒子之間的聚集[18]。

圖4 不同油濃度下乳狀液的ζ-電位Fig.4 ζ-potential of emulsions with different oil concentrations

2.3 大豆分離蛋白和油濃度對乳狀液離心穩(wěn)定性的影響

2.3.1 大豆分離蛋白濃度對乳狀液離心穩(wěn)定性的影響

圖5 為大豆分離蛋白濃度對乳狀液離心穩(wěn)定性的影響。由圖可以看出，隨著大豆分離蛋白濃度的升高，離心穩(wěn)定系數(shù)先增大后減少，當?shù)鞍诐舛葹?.0%時，離心穩(wěn)定系數(shù)最大，為88%，表明此時的乳狀液最穩(wěn)定。當大豆蛋白濃度為2.0%時，乳狀液的離心穩(wěn)定系數(shù)下降為76%。根據(jù)斯托克斯定律，提高分層穩(wěn)定性可以通過減小液滴粒徑、升高連續(xù)相黏度或者減小液滴和連續(xù)相之間的密度差來達到。按照這個定律分析乳狀液穩(wěn)定性的變化趨勢，大豆分離蛋白濃度在0.1%～1.0%時，乳狀液穩(wěn)定性逐步上升，分析原因是連續(xù)相中未吸附的粒子的存在形成了粒子和液滴之間的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，升高了連續(xù)相的黏度，減緩了液滴的遷移；另一方面大豆分離蛋白包覆在油滴表面增加了油滴的密度，減小了油滴和連續(xù)相的密度差；之后，由于大豆蛋白在界面及液相中的相互纏結(jié)，促進了液滴之間的絮凝，從而導致過高濃度的大豆蛋白降低了乳液的分層穩(wěn)定性[19-20]。

圖5 大豆分離蛋白濃度對乳狀液離心穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of soybean protein isolate concentration on centrifugal stability of emulsions

2.3.2 油濃度對乳狀液離心穩(wěn)定性的影響

圖6 為油濃度對乳狀液離心穩(wěn)定性的影響，可以看出隨著油濃度的提升，靈芝孢子油乳狀液離心穩(wěn)定性不斷下降，由90%逐步下降為27%，這是由于油濃度過高，而大豆蛋白的乳化能力有限，不能形成足夠多的乳狀液顆粒，不能減小油滴和連續(xù)相的密度差，從而導致乳狀液不穩(wěn)定[21]。根據(jù)上述結(jié)果，選擇0.5%濃度的大豆分離蛋白和0.5%靈芝孢子油含量來制備乳狀液比較合適。

圖6 不同油濃度對乳狀液離心穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of different oil concentrations on the centrifugal stability of emulsions

2.4 乳狀液的儲藏穩(wěn)定性

2.4.1 儲藏過程中乳狀液粒徑的變化

圖7 為0.5%大豆分離蛋白-0.5%靈芝孢子油乳狀液儲藏10 d 內(nèi)的粒徑變化圖。由圖可知，乳狀液粒徑在前2d 變化不明顯，在第2 天時，乳狀液粒徑峰位于150 nm和700 nm 左右。當儲藏至第5 天時，粒徑出現(xiàn)明顯的增大，兩個峰分別位于190 nm 和1 400 nm 處。第7 天，乳狀液粒徑又進一步增大。第10 天時乳狀液粒徑幾乎只剩下一個單峰，位于2 500 nm 處左右，此時乳狀液出現(xiàn)了大顆粒聚集。

圖7 乳狀液儲藏過程中的粒徑變化Fig.7 Size distribution of emulsions during storage

2.4.2 儲藏過程中乳狀液電位的變化

圖8 為0.5%大豆分離蛋白-0.5%靈芝孢子油乳狀液儲藏10 d 內(nèi)的ζ-電位變化圖。由圖可以看出，乳狀液在儲藏2d 后ζ-電位變化不明顯，第2 天絕對值為58.46 mV。儲藏至第5 天時，乳狀液的ζ-電位絕對值明顯變小，為36.71 mV。儲存至第10 天時，ζ-電位的絕對值最小，為10.29 mV。乳狀液的絕對值小于20 mV，說明此時的乳狀液已經(jīng)不穩(wěn)定。

圖8 乳狀液儲藏過程中ζ-電位變化Fig.8 ζ-potential of emulsions during storage

2.5 乳狀液的氧化穩(wěn)定性

圖9（見下頁）為儲藏過程中乳狀液的氧化穩(wěn)定性，為0.5%大豆蛋白與0.5%靈芝孢子油經(jīng)均質(zhì)制備而成的乳狀液，并在其中加入了不同種類的抗氧化劑。在第1 天時，所有乳狀液的過氧化值基本接近，其中對照組的過氧化值最大，為0.45 mmol/kg。儲藏至第2 天時，對照組的過氧化值明顯增大，為2.25 mmol/kg，其次為乳狀液（0.98 mmol/kg）。而加入抗氧化劑保護的乳狀液，過氧化值變化不明顯。儲藏至第5 天時，差距進一步拉大，加入抗氧化劑的保護優(yōu)勢凸顯出來，三者差距不大，對照組為3.76 mmol/kg，乳狀液的過氧化值之間為2.75 mmol/kg。儲藏至第7 天時，對照組與乳狀液的差距明顯，茶多酚和抗壞血酸具有良好的保護效果，相比對照組的7.77 mmol/kg，僅為1.2 mmol/kg。儲藏到第10 天時，過氧化值大小順序為對照＞乳狀液＞大豆異黃酮＞抗壞血酸＞茶多酚，過氧化值分別為10.12、7.15、4.04、2.88、1.88 mmol/kg。與對照組相比，乳狀液的過氧化值降低了29.24%，加入了茶多酚的乳狀液則降低了81.42%。說明乳狀液對靈芝孢子油具有良好的保護效果，加入抗氧化劑后，保護效果進一步增強，其中茶多酚的效果最好。

圖9 乳狀液儲藏過程中過氧化值變化Fig.9 Peroxide values of emulsions during storage

3 結(jié)論

本文利用大豆分離蛋白的乳化特性構(gòu)建水包油型乳狀液，將靈芝孢子油作為油相包埋在內(nèi)部，通過研究蛋白和油濃度對乳狀液體系穩(wěn)定性的影響，構(gòu)建最佳的乳狀液包埋體系。制備的乳狀液均呈現(xiàn)雙峰分布。當?shù)鞍诐舛葹?.1%～0.5%時，隨著蛋白濃度的增加，乳狀液粒徑分布變小，說明乳狀液穩(wěn)定性有所改善。制備的乳狀液的ζ-電位絕對值均大于20 mV。隨著大豆蛋白濃度的升高，乳狀液離心穩(wěn)定系數(shù)增大，由最低的25%提升到88%，當?shù)鞍诐舛葹?.0%時，離心穩(wěn)定系數(shù)最大，表明此時的乳狀液最穩(wěn)定。隨著油濃度的提升，靈芝孢子油乳狀液離心穩(wěn)定性在不斷下降。當油濃度為1.0%時，乳狀液離心穩(wěn)定系數(shù)很低。綜合粒徑和電位數(shù)據(jù)，當?shù)鞍诐舛葹?.5%和油濃度為0.5%時，能制得穩(wěn)定性較好的乳狀液。當儲藏至第5 天，粒徑出現(xiàn)明顯的增大，ζ-電位絕對值變小。儲藏到第10 天時，過氧化值從大到小的順序分別為對照＞乳狀液＞大豆異黃酮＞抗壞血酸＞茶多酚。表明大豆分離蛋白制備的乳狀液可以有效包埋靈芝孢子油，并能有效增強靈芝孢子油的氧化穩(wěn)定性。本文為靈芝孢子油在食品保健領(lǐng)域的應用以及液體口服類產(chǎn)品的開發(fā)提供理論支持。