崔艷平，聶 瑋，岳鳳麗，肖環(huán)環(huán)，孫慶澤，郭啟振，張淦淇，孫廣茹

（1.山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250100；2.山東現(xiàn)代學(xué)院，山東濟(jì)南 250100）

紅薯葉是紅薯莖上的葉子，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值非常高，對(duì)人體有很好的保健作用。紅薯葉中富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如多酚、蛋白質(zhì)、維生素等[1-3]，具有抗腫瘤、抗菌、提高免疫力、抗氧化等作用[4-6]。當(dāng)前已將紅薯葉應(yīng)用于藥品和食品加工等方面。在紅薯葉的綜合利用方面起主要作用的是其中的功能活性成分，如多酚等。目前，國(guó)內(nèi)外科研人員對(duì)植物多酚的研究越來(lái)越多，但是將紅薯葉作為原料提取多酚的研究則較少，且紅薯葉多酚的提取率較低，難以滿足紅薯葉在藥品和食品加工等方面的綜合開發(fā)和利用。隨著科技的發(fā)展，在植物多酚提取方面出現(xiàn)了很多新興技術(shù)，如超聲波、微波、生物酶解等，當(dāng)前在紅薯葉多酚提取方面已經(jīng)應(yīng)用的有超聲波輔助提取、微波輔助提取和動(dòng)態(tài)高壓微射流（DHPM）等技術(shù)，超聲輔助提取時(shí)間通常為24～40 min，微波輔助提取時(shí)間通常為10～25 min，提取時(shí)間均較長(zhǎng)，會(huì)損害多酚中的一些不飽和成分。

超聲微波協(xié)同提取技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展較快的一種輔助提取技術(shù)[7-8]，耗時(shí)短，通常為8～15 min，減少了多酚類物質(zhì)的損失。目前應(yīng)用超聲微波協(xié)同提取技術(shù)提取紅薯葉多酚的相關(guān)報(bào)道較少。本研究利用超聲微波協(xié)同提取技術(shù)提取紅薯葉中的多酚物質(zhì)，并采用響應(yīng)面法對(duì)超聲微波協(xié)同提取紅薯葉多酚的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，探究紅薯葉中多酚物質(zhì)的抗氧化活性，為紅薯葉多酚的科學(xué)研究和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮紅薯葉，品種為‘福薯’，產(chǎn)自山東泰安。

無(wú)水乙醇、無(wú)水碳酸鈉、福林酚試劑、沒食子酸、DPPH（1,1-二苯基-2-苦肼基）、VC（抗壞血酸）、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、過硫酸鉀（K2S2O8），均為分析純，購(gòu)自上海沃凱生物技術(shù)有限公司。

CW130 粉碎機(jī)，上海天祥健臺(tái)制藥工程師機(jī)械有限公司；KH-6HMTN 微波農(nóng)產(chǎn)品干燥殺菌裝置，山東科弘微波節(jié)能有限公司；XO-SM00 超聲波微波組合系統(tǒng)，中國(guó)南京先歐儀器制造股份有限公司；TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南省長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；V5000 型可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；LE104E/02 電子天平，梅特勒-托利多儀器（中國(guó)上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 紅薯葉多酚的提取

將新鮮紅薯葉在400 W 條件下微波干燥10～15 min，置于超微粉碎機(jī)中低溫粉碎20 min，粉碎后過300 目的篩，得紅薯葉粉末。稱取2.00 g 紅薯葉粉末放入提取瓶中，按一定的料液比加入濃度為60%的無(wú)水乙醇溶液，攪拌均勻，按照一定的超聲功率、超聲時(shí)間、微波功率、微波時(shí)間提取紅薯葉多酚物質(zhì)。將提取液放入離心管中，配平后，放入離心機(jī)以4 000 r/min 離心15 min，取上清液，即得到多酚提取液。

1.2.2 紅薯葉多酚含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取0.001 g 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水溶解定容至100 mL，此溶液中沒食子酸含量為10 μg/mL。再精密吸取0、1、2、3、4、5、6 mL 溶液到10 mL 比色管中，加入0.5 mL 福林酚，充分搖勻，靜止1 min，加入1 mL、7.5%Na2CO3溶液（7.5 g 無(wú)水碳酸鈉定容于100 mL 容量瓶中），定容至10 mL 比色管中，在避光條件下，在40 ℃水浴中靜置1 h，以蒸餾水為參照，在760 nm 處測(cè)定吸光度值。以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以樣品的吸光度值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]。

紅薯葉多酚測(cè)定采用福林酚法。多酚將提取液稀釋5 倍，向10 mL 比色管中加入稀釋好的提取液1 mL，再加入0.5 mL 福林酚試劑，振蕩1 min 后，加入1 mL、7.5%Na2CO3溶液，黑暗條件下放置1 h。以蒸餾水為空白對(duì)照，測(cè)量其在760 nm 下的吸光度值。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到紅薯葉中多酚的濃度，并按公式（1）計(jì)算多酚提取率。

式中，E為紅薯葉多酚提取率，%；C為待測(cè)液中多酚的濃度，μg/mL；A 為稀釋倍數(shù)，50；V為提取液的總體積，mL；m為稱取的紅薯葉粉末的質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

設(shè)置料液比（1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45）、超聲時(shí)間（5、10、15、20、25 min）、超聲功率（100、200、300、400、500 W）、微波功率（150、250、350、450、550 W）和微波時(shí)間（1、2、3、4、5 min）為單因素條件，研究不同因素對(duì)紅薯葉多酚提取率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為前提，以料液比、微波功率和微波時(shí)間作為主要的自變量，紅薯葉多酚的提取率作為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.5 抗氧化試驗(yàn)

（1）DPPH 自由基清除能力的測(cè)定

參考崔鏨等[10]的方法，設(shè)置溶液濃度梯度，分別配制濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g/mL 的紅薯葉多酚溶液和0.2 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液。在10 mL 試管中分別加入2 mL 不同濃度的紅薯葉多酚溶液和2 mL 的DPPH 乙醇溶液。搖勻后，暗反應(yīng)30 min。在70%乙醇的參照下，設(shè)置波長(zhǎng)為517 nm，測(cè)定吸光度值。同時(shí)用VC做對(duì)照，按照公式（2）計(jì)算其DPPH 自由基的清除率。

式中，A0為DPPH 溶液與無(wú)水乙醇的吸光值；A1為DPPH 溶液與不同濃度的樣品溶液的吸光值；A2為不同濃度的樣品溶液與無(wú)水乙醇的吸光值。

（2）ABTS 自由基清除能力的測(cè)定

參考馬慧等[11]的方法，用移液槍取0.2 mL、2.6 mmol/L的K2S2O8溶液和相同體積的7.4 mmol/L 的ABTS 溶液混合，無(wú)光即黑暗條件下放置12 h，濃縮40～50 倍，在波長(zhǎng)為734 nm 下測(cè)定其吸光度值，若該值保持在0.7±0.02，則表明ABTS 工作液配置完成。吸取3.2 mL 的工作液和0.8 mL 不同濃度下的紅薯葉多酚溶液混合，振搖10 s 使其充分混勻，上述樣品靜置6 min 后，在734 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值。與此同時(shí)，用VC 做對(duì)照，按照公式（3）計(jì)算其ABTS 自由基的清除率。

式中，A0表示3.2 mL 工作液＋0.8 mL 95%乙醇的吸光值；A表示3.2 mL 工作液＋0.8 mL 樣品溶液的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，作圖運(yùn)用Origin 8.5，響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)應(yīng)用Design-Expert V8.0.6.1 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸關(guān)系

由1.2.2 得到線性回歸方程為y=0.007 1x+0.020 9（R2=0.999 7），可知具有良好的線性關(guān)系。

2.2 紅薯葉多酚提取的單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)紅薯葉中多酚提取率的影響

由圖1（見下頁(yè)）可知，隨著料液比的增加，紅薯葉多酚的提取率先升高后降低，當(dāng)料液比為1∶35 時(shí)，提取率最大，為3.48%。當(dāng)料液比小于1∶35 時(shí)，紅薯葉多酚的提取率變低，說(shuō)明溶液增多，使多酚濃度降低，導(dǎo)致超聲微波提取效率降低。而當(dāng)料液比大于1∶35 時(shí)，提取劑與物料之間的接觸面積隨著溶劑的增多而變大[12]，增加了紅薯葉多酚的提取率。因此，料液比選擇1∶35。

圖1 紅薯葉多酚提取率受料液比的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of polyphenols from sweet potato leaves

2.2.2 超聲時(shí)間對(duì)紅薯葉多酚提取率的影響

由圖2 可知，當(dāng)超聲時(shí)間小于10 min 時(shí)，紅薯葉多酚提取率隨超聲時(shí)間的增加而增加，當(dāng)超聲時(shí)間為10min時(shí)，達(dá)到最大值，為3.59%；再增加超聲時(shí)間，提取率降低，可能是超聲時(shí)間過長(zhǎng)，對(duì)多酚造成了一定程度的損害；之后逐漸平緩，是因?yàn)榇藭r(shí)物料內(nèi)部的多酚物質(zhì)可能已經(jīng)被提取完全。因此，超聲時(shí)間選擇10 min。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)紅薯葉多酚提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the extraction yield of polyphenols from sweet potato leaves

2.2.3 超聲功率對(duì)紅薯葉多酚提取率的影響

由圖3 可知，超聲功率小于300 W 時(shí)，紅薯葉多酚的提取率隨超聲功率的增加而逐漸增大，提取率最大為3.58%，此時(shí)超聲功率為300 W。而當(dāng)超聲功率大于300 W時(shí)，紅薯葉多酚的提取率逐漸下降。提取率先增加后降低的原因可能是開始提取率隨功率增大而增大，當(dāng)超聲功率過大時(shí)，會(huì)對(duì)多酚造成一定的損害，使提取率降低，當(dāng)多酚被提取完全時(shí)，提取率趨于平緩。因此，超聲功率300 W 為紅薯葉多酚提取的最適條件。

圖3 超聲功率對(duì)紅薯葉多酚提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of polyphenols from sweet potato leaves

2.2.4 微波功率對(duì)紅薯葉多酚提取率的影響

由圖4 可知，當(dāng)微波功率小于350 W 時(shí)，紅薯葉多酚提取率隨微波功率的增加而增大。提取率最大為3.55%，此時(shí)微波功率為350 W。再增加微波功率，紅薯葉多酚提取率反而減小。提取率先增后降的原因可能是開始提取率隨微波功率增大而增大，當(dāng)微波功率過大時(shí)，會(huì)對(duì)多酚造成一定的損害，使得提取率降低，當(dāng)多酚被提取完全時(shí)，提取率趨于平緩。因此，微波功率350 W 為紅薯葉多酚提取的最適條件。

圖4 微波功率對(duì)紅薯葉多酚提取率的影響Fig.4 Effect of microwave power on the extraction yield of polyphenols from sweet potato leaves

2.2.5 微波時(shí)間對(duì)紅薯葉多酚提取率的影響

由圖5 可知，隨著微波時(shí)間的逐漸增加，紅薯葉多酚的提取率逐漸增大，當(dāng)微波時(shí)間為2 min 時(shí)，紅薯葉多酚提取率最大，為3.44%；此后隨著時(shí)間的增加，紅薯葉多酚提取率降低，可能是隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，空氣中的氧氣氧化了紅薯葉中的多酚物質(zhì)，導(dǎo)致紅薯葉多酚提取率下降；而多酚提取率又升高可能是由于體系中的溫度升高使分子運(yùn)動(dòng)加快，多酚浸出量增加；再次降低是微波時(shí)間過長(zhǎng)對(duì)多酚造成了一定程度的損害，降低了提取率。因此，微波時(shí)間2min 為最適合紅薯葉多酚提取的條件。

圖5 微波時(shí)間對(duì)紅薯葉多酚提取率的影響Fig.5 Effect of microwave time on the extraction yield of polyphenols from sweet potato leaves

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

通過Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以紅薯葉多酚提取率（Y）為響應(yīng)值，選擇料液比（A）、微波功率（B）、微波時(shí)間（C）為影響因素，得出試驗(yàn)結(jié)果如表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Test results of response surface

對(duì)表2 的各組數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得到擬合方程為Y=3.61-0.025A+0.028B+0.17C+0.01AB-0.18AC+0.035BC-0.27A2-0.32B2-0.12C2。

2.3.2 方差分析結(jié)果

由表3 可知，模型的F=6.420，相應(yīng)的P=0.011 4＜0.05，表明該模型顯著。校正決定系數(shù)R2=0.891 9＞0.80，表明模型有很好擬合性，模型的調(diào)整Radj=0.752 9，表明該模型能夠解釋75.29%的響應(yīng)值的變化，可用于對(duì)超聲微波協(xié)同提取法提取紅薯葉多酚的工藝過程進(jìn)行初步分析和預(yù)測(cè)。失擬項(xiàng)的P＝0.085 9＞0.05，表明不顯著，沒有失擬因素存在，因此對(duì)試驗(yàn)結(jié)果可以用該回歸方程進(jìn)行分析[13-14]。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

一次項(xiàng)C、交互項(xiàng)AC 對(duì)紅薯葉多酚提取率影響顯著，二次項(xiàng)A2、B2對(duì)紅薯葉多酚的提取率影響極顯著，其余影響不顯著。通過比較F值的大小，得出影響響應(yīng)值的順序?yàn)镃＞B＞A，即微波時(shí)間＞微波功率＞料液。

2.4 紅薯葉多酚提取的響應(yīng)面分析及最佳條件驗(yàn)證

據(jù)Box-Behnke 8.0 軟件，研究料液比、微波功率和微波時(shí)間對(duì)紅薯葉多酚提取率的影響，結(jié)果如圖6～8。

圖6 紅薯葉多酚提取率受AB 影響的響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surface diagram of polyphenols extraction rate of sweet potato leaves affected by AB

圖7 紅薯葉多酚提取率受BC 影響的響應(yīng)曲面圖Fig.7 Response surface diagram of the extraction rate of polyphenols from sweet potato leaves affected by BC

圖8 紅薯葉多酚提取率受AC 影響的響應(yīng)曲面圖Fig.8 Response surface diagram of polyphenols extraction rate of sweet potato leaves affected by AC

從圖中可以看出，響應(yīng)值隨試驗(yàn)因素變化均先升高后降低，并在試驗(yàn)水平范圍內(nèi)出現(xiàn)一個(gè)最高點(diǎn)，即為紅薯葉多酚提取率的較高點(diǎn)。通過響應(yīng)面模型分析得到，紅薯葉多酚最適提取條件為料液比1∶31.21，微波功率368.54 W，微波時(shí)間5.04 min，在此條件下紅薯葉多酚提取率為3.71%。

為了提高試驗(yàn)的方便性，保持其他條件不變，調(diào)整料液比為1∶32、微波功率為368 W、微波時(shí)間為5 min，做3 次平行試驗(yàn)，測(cè)得紅薯葉多酚提取率的平均值為3.70%，與響應(yīng)面設(shè)計(jì)預(yù)測(cè)得出的紅薯葉多酚提取率相差不大，再次證明了模型的可行性。

2.5 抗氧化結(jié)果

由圖9 可知，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度從0.01 mg/mL 增加至0.02 mg/mL 時(shí)，紅薯葉多酚對(duì)DPPH 自由基的清除率隨樣品質(zhì)量濃度的提高從51.93%增加至78.80%，之后緩慢增加。紅薯葉多酚對(duì)DPPH 自由基的清除率始終低于VC對(duì)DPPH 自由基的清除率，并且兩者的變化趨勢(shì)相近。

圖9 不同樣品質(zhì)量濃度對(duì)DPPH 自由基清除率的影響Fig.9 Influence of different sample mass concentrations on DPPH free radical scavenging rate

由圖10 曲線的走向可以看出，紅薯葉多酚對(duì)ABTS自由基的清除能力隨樣品質(zhì)量濃度增加而增大，但始終低于VC對(duì)ABTS自由基的清除率。當(dāng)濃度為0.016 mg/mL時(shí)，紅薯葉多酚和VC 的最大清除率分別達(dá)到92.76%和99.62%。通過試驗(yàn)分析得出，紅薯葉多酚清除DPPH 自由基和ABTS 自由基的IC50值分別為0.000 3 mg/mL 與0.006 7 mg/mL。當(dāng)某種物質(zhì)具有一定的抗氧化作用時(shí)，該物質(zhì)清除自由基的IC50小于10 mg/mL[15]。該結(jié)果表明，紅薯葉多酚對(duì)DPPH 自由基和ABTS 自由基的清除有一定的作用。

圖10 紅薯葉多酚對(duì)ABTS 自由基清除率的影響Fig.10 Effects of polyphenols in sweet potato leaves on ABTS free radical scavenging rate

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面的優(yōu)化設(shè)計(jì)，得到料液比1∶32（g/mL）、超聲時(shí)間10 min、超聲功率300 W、微波功率368 W、微波時(shí)間5 min 為超聲微波協(xié)同提取紅薯葉多酚的最佳提取條件，提取率達(dá)到3.71%。通過對(duì)紅薯葉多酚抗氧化能力的測(cè)定，測(cè)得紅薯葉多酚清除DPPH 自由基和ABTS 自由基的IC50值均小于10 mg/mL，表明紅薯葉多酚可以作為天然抗氧化劑的來(lái)源。