嚴(yán)婕妮，許馨予，李 欣，楊 濤

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 南京 210029

1型糖尿?。╰ype 1 diabetes，T1D）是一種由環(huán)境因素、基因組、代謝與自身免疫系統(tǒng)之間相互作用而引發(fā)的，以T 細(xì)胞介導(dǎo)胰島β細(xì)胞破壞，從而導(dǎo)致胰島素分泌減少或胰島素絕對缺乏為特征的慢性自身免疫性疾病［1］。其免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制主要是活化的B細(xì)胞與CD4+和CD8+T細(xì)胞的相互作用?；蛞赘行院筒《靖腥镜拳h(huán)境因素導(dǎo)致帶有β細(xì)胞抗原肽的B細(xì)胞抗原遞呈，驅(qū)動(dòng)了自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞的激活，進(jìn)而介導(dǎo)CD8+T細(xì)胞的活化。活化的CD8+T細(xì)胞返回胰島，通過釋放穿孔素和顆粒酶以接觸依賴性方式殺傷胰島β細(xì)胞。胰島β細(xì)胞損傷后不斷釋放胰島自身抗原，誘導(dǎo)自身反應(yīng)性CD4+和CD8+T細(xì)胞對胰島的進(jìn)一步攻擊，最終導(dǎo)致胰島β細(xì)胞衰竭引起T1D的發(fā)生。因此CD8+T細(xì)胞是T1D發(fā)生和進(jìn)展的關(guān)鍵［2］，而胰島炎或免疫浸潤胰島則是該疾病的標(biāo)志性病理學(xué)特征［3-4］。

濾泡細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（follicular cytotoxic T cells，TFC）是一種特異性表達(dá)CXCR5+的CD8+T細(xì)胞亞群（即CXCR5+CD8+T細(xì)胞），它可以抑制B細(xì)胞濾泡中病原體感染細(xì)胞，也可能有助于記憶性特異性效應(yīng)細(xì)胞毒性CD8+T 細(xì)胞（cytotoxic T cells，TC）的發(fā)育［5］。TC由機(jī)體感染后的抗原特異性CD8+T細(xì)胞在次級淋巴器官的T 細(xì)胞區(qū)中分化而成，其目的是為了清除感染細(xì)胞［6-7］。TFC的比例在慢性感染（如淋巴感染）中尤其高，TFC 通過CXCR5 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)遷移至B細(xì)胞濾泡，表達(dá)低水平的抑制性受體，并且比CXCR5-CD8+T細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞毒性，在濾泡中發(fā)揮著清除病毒感染細(xì)胞的作用［8］。在腫瘤相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，TFC在腫瘤組織和腫瘤相關(guān)淋巴結(jié)中富集，且在體外比CXCR5-CD8+T細(xì)胞更有效地介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，具有抗腫瘤免疫的潛能［9-11］。目前，對TFC的探索主要集中在慢性感染及腫瘤，在自身免疫性疾病中對這群細(xì)胞的表型、功能、來源、產(chǎn)生的機(jī)制以及與其他細(xì)胞之間的相互作用的研究少之又少。因此，基于TFC的既往研究結(jié)果，本文推測TFC在胰島炎進(jìn)程中和T1D的致病環(huán)節(jié)或存在一定關(guān)聯(lián)。

非肥胖糖尿?。╪on?obese diabetic，NOD）小鼠因其遺傳復(fù)雜性、對特定主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ（major histocompatibility complex Ⅱ，MHC Ⅱ）類等位基因的易感性等方面近似于人類T1D，而成為研究T1D 最主要的動(dòng)物模型［12-13］。因此在本研究中，選取NOD小鼠作為研究對象，通過觀察TFC在不同周齡NOD 小鼠的不同組織中的表達(dá)量及其表達(dá)脫顆粒標(biāo)記物白細(xì)胞分化抗原（cluster of differentia?tion 107a，CD107a）和重組人殺傷細(xì)胞凝集素樣受體G亞族成員1（recombinant human killer cell lectin?like receptor subfamily G，member 1，KLRG1）、抑制性分子程序性死亡分子1（programmed cell death pro?tein 1，PD?1）和T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白結(jié)構(gòu)分子3（T cell immunoglobulin mucin 3，TIM?3）的表達(dá)水平，以及其分泌干擾素γ（interferon γ，IFN?γ）、顆粒酶B（granzyme B，GzmB）的能力，初步發(fā)掘與探討TFC與T1D之間存在的關(guān)聯(lián)。

1 材料和方法

1.1 材料

雌性NOD小鼠（4～25周齡），購買于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所。NOD 小鼠均在南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級環(huán)境中喂養(yǎng)。此次實(shí)驗(yàn)中所有的過程及操作均遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例，符合南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)的規(guī)范，并獲得倫理會(huì)的批準(zhǔn)（IACUC 14030143?2）。

抗鼠APC/Cy7 CD3 抗體、抗鼠PerCP/Cy5.5 CD8a 抗體、抗鼠PE CD185（CXCR5）抗體、抗人/鼠Alexa Fluor700 CD44 抗體、抗鼠APC CD279（PD?1）抗體、抗鼠APC CD336（TIM?3）抗體、抗鼠APC CD107a 抗體、抗人/鼠APC KLRG1 抗體、抗人/鼠FITC Granzyme B 抗體、抗鼠Brilliant Violet 421 IFN?γ抗體（Biolegend公司，美國）。

NaCl（汕頭市西隴化工廠有限公司），KCl、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4·12H2O、KHCO3、NH4Cl、EDTA（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司），胎牛血清（Gibco 公司，美國），RPMI 1640 培養(yǎng)基、青霉素?鏈霉素雙抗（Thermo Fisher Scientific公司，美國）。

FACS Calibur 流式細(xì)胞儀、FACS Aria 流式細(xì)胞儀、流式專用試管（BD 公司，美國），血糖儀、血糖試紙（TERUMO公司，日本），15 mL離心管、50 mL離心管（Corning公司，美國），細(xì)胞培養(yǎng)箱、落地高速離心機(jī)（Thermo Fisher Scientific公司，美國），生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），渦振蕩器IKA Vor?tex Genius 3（IKA公司，德國）、移液器（1 mL/200 μL/50 μL/10 μL/2.5 μL）（Dragonmed公司，芬蘭）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組

選取4、10、15、20、25周齡及高血糖（hyperglyce?mia，Hi）組NOD小鼠經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)10周后，每周測量血糖，2次重復(fù)血糖值＞16.7 mmol/L被認(rèn)為是顯性糖尿?。锤哐墙M），隨機(jī)分成6組，每組6～10只。

1.2.2 脾臟、淋巴結(jié)和胸腺組織分離

提前準(zhǔn)備好培養(yǎng)皿，皿內(nèi)鋪置一張200 目尼龍濾膜并提前加入5 mL 緩沖液（Adding Buffer）（99%PBS 緩沖液加上1%胎牛血清），將皿放置于冰盒內(nèi)。將每組NOD 小鼠摘除眼球放血，頸部脫臼處死，并置于75%乙醇中浸泡數(shù)分鐘，之后將NOD 小鼠固定于解剖操作臺上（提前將固定針、眼科剪、鑷子浸泡于75%乙醇中數(shù)分鐘），無菌分離摘取小鼠脾臟、淋巴結(jié)（腹股溝、腋下、腸系膜、腹主動(dòng)脈旁處引流淋巴結(jié)）、胸腺。將取出的器官組織放入提前準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿中。

在脾臟、淋巴結(jié)、胸腺上分別覆蓋一層200 目濾膜，用5 mL 無菌注射器末端研磨，將研磨液吸入15 mL 離心管中，再用5 mL Adding Buffer 液沖洗濾膜，同時(shí)將沖洗液也移入離心管中。將離心管置于離心機(jī)水平轉(zhuǎn)子中，經(jīng)4 ℃、1 500 r/min離心5 min，棄上清，重懸細(xì)胞。將重懸后的細(xì)胞加入Adding Buffer定容至1 mL細(xì)胞懸液，加入10 mL紅細(xì)胞裂解液（1×），將離心管于冰上靜置5 min 后，4 ℃、1 500 r/min 離心5 min。棄上清，重懸細(xì)胞并加入10 mL Adding Buffer 洗滌細(xì)胞1 次。棄上清，用1mL Adding Buffer重懸細(xì)胞并經(jīng)200目尼龍濾膜將細(xì)胞懸液過濾（以除去細(xì)胞碎片）至另一15 mL離心管中。經(jīng)顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)并取2×106個(gè)細(xì)胞，用于流式抗體標(biāo)記及檢測。

1.2.3 細(xì)胞表面流式抗體標(biāo)記染色

取分離好的脾臟、淋巴結(jié)、胸腺組織的細(xì)胞2×106個(gè)分別置于流式管中，取適量流式熒光抗體進(jìn)行細(xì)胞染色，加入1.25 μL 抗鼠CD3?APC/Cy7 抗體、1.25 μL 抗鼠CD8a?PerCP/Cy5.5 抗體，1 μL 抗鼠CD185（CXCR5）?PE 抗體、0.5 μL 抗鼠/人CD44?Al?exa Fluor 700 抗體，震蕩混勻，再分別加入抗鼠CD279（PD?1）?APC抗體、抗鼠CD107a?APC抗體、抗鼠KLRG1?APC 抗體、抗鼠TIM3?APC 抗體各1 μL，震蕩混勻。4 ℃避光靜置15 min。加3 mL PBS重懸細(xì)胞，4 ℃、1 500 r/min 離心5 min。棄上清，并加入200 μL PBS 重懸細(xì)胞。最后將樣品置于流式細(xì)胞儀中上機(jī)檢測。

1.2.4 細(xì)胞胞內(nèi)因子流式抗體標(biāo)記染色

配制刺激劑：1640 完全培養(yǎng)基+75 ng/mL 佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）+1 μg/mL 離子霉素（Ionomycin）+10 μg/mL 布雷非德菌素A（Brefeld?in A，BFA）。取分離好的脾臟、淋巴結(jié)、胸腺組織的細(xì)胞2×106個(gè)分別置于流式管中，每管加入1 mL 提前配制好的刺激劑，置于5%CO2的37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中刺激5～6 h。刺激結(jié)束后，加入3 mL Add?ing Buffer，4 ℃、1 500 r/min 離心5 min。棄上清，避光條件下加入1.25 μL 抗鼠CD8a?PerCP/Cy5.5 抗體。震蕩混勻。4 ℃避光靜置15 min。加3 mL Add?ing Buffer重懸細(xì)胞，4 ℃、1 500 r/min離心5 min。棄上清，加入100 μL破膜劑A，重懸后，室溫避光靜置15 min。加3 mL Adding Buffer 重懸細(xì)胞，4 ℃、1 500 r/min 離心5 min。棄上清，加入100 μL 破膜劑B，3 μL 抗人/鼠Granzyme B?FITC 抗體、0.5 μL 抗鼠IFN?γ?Brilliant Violet 421 抗體。震蕩混勻。4 ℃避光靜置30 min。加入3 mL Adding Buffer 重懸細(xì)胞，1 500 r/min，溫度4 ℃的條件離心5 min，棄去上清，并加入200 μL Adding Buffer 重懸細(xì)胞。最后將樣品置于流式細(xì)胞儀中上機(jī)檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用FlowJo vX.0.7流式分析軟件分析流式結(jié)果；使用GraphPad Prism 7.0做圖軟件進(jìn)行圖形處理。涉及的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法包括t檢驗(yàn)、單因素方差分析（組間比較前均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，不滿足正態(tài)分布或方差齊性則使用非參數(shù)檢驗(yàn)方法）、多重假設(shè)檢驗(yàn)。多組間比較使用Kruskal?Wallis 檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TFC在NOD小鼠脾臟、淋巴結(jié)細(xì)胞比例遠(yuǎn)高于胸腺

為了觀察TFC 在NOD 小鼠中不同免疫器官間的分布是否存在差異，分別取小鼠脾臟、淋巴結(jié)（包括胰腺周圍引流淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)、腋窩淋巴結(jié)、腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)）和胸腺組織，提取組織中的淋巴細(xì)胞。參考慢性感染和癌癥研究中對TFC 表型的探究，選定CD3、CD8、CD44、CXCR5 為本研究中TFC 的抗體標(biāo)記，染色后進(jìn)行流式細(xì)胞檢測，CD3+CD8+CD44+CXCR5+T細(xì)胞即為TFC（圖1A）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TFC 分布存在組織差異，在NOD 小鼠脾臟、淋巴結(jié)中的細(xì)胞比例較高，且脾臟中的表達(dá)量略高于淋巴結(jié)，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（各組P＞0.05，圖1B）。TFC在胸腺中幾乎無表達(dá)。這一結(jié)果提示，TFC主要存在于NOD小鼠的脾臟和淋巴結(jié)中，可能參與了NOD小鼠自身免疫性糖尿病的進(jìn)展。

圖1 TFC在NOD小鼠不同免疫器官中的分布比例Figure 1 Proportion and distribution of TFC in different immune organs of NOD mice

2.2 發(fā)生高血糖前TFC 細(xì)胞比例隨NOD 小鼠周齡延長而增高

為觀察NOD 小鼠自身免疫性糖尿病自然病程的不同階段及發(fā)病后TFC 的細(xì)胞比例在脾臟和淋巴結(jié)中的變化，分別選取了4、10、15、20、25 周及高血糖組（Hi）NOD小鼠，分別代表自身免疫性糖尿病胰島炎由輕到重的不同階段，以及糖尿病發(fā)病的不同疾病進(jìn)程。將各組小鼠的脾臟和淋巴結(jié)分離出來，取其淋巴細(xì)胞并進(jìn)行流式染色，流式圖中CD44+CXCR5+細(xì)胞群為CXCR5+CD8+T 細(xì)胞（即TFC），CD44+CXCR5-細(xì)胞群為CXCR5-CD8+T細(xì)胞，以此觀察2種細(xì)胞比例的變化（圖2A、C）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與CXCR5-CD8+T 細(xì)胞相比，TFC 的細(xì)胞比例，無論是在脾臟（4、10、15、20、25 周組、Hi 組，P＜0.000 1，圖2B）還是在淋巴結(jié)（4、20、25 周組、Hi 組，P＜0.001；10周組，P＜0.05；15周組，P＜0.01，圖2D）中均明顯較低，僅占總CD8+T 細(xì)胞比例的3%～10%。在NOD 小鼠發(fā)病前，隨著小鼠周齡延長、胰島炎程度的加重，TFC細(xì)胞比例呈現(xiàn)逐漸增高趨勢，但是在小鼠發(fā)生高血糖后，TFC細(xì)胞比例在脾臟（4周組vs.25周組，P＜0.01；4周組vs.Hi組，P＜0.05，圖2B）和淋巴結(jié)（4周組vs.25周組，P＜0.000 1；10周組vs.25周組，P＜0.01；15 周組vs.25 周組，P＜0.001；20 周組vs.25 周組，P＜0.001；25 周組vs.Hi 周組，P＜0.01，圖2D）中均有下降。這一結(jié)果提示，TFC 確實(shí)參與了NOD小鼠自身免疫性糖尿病的自然病程，并且根據(jù)先前其他研究的結(jié)果，推測TFC對淋巴細(xì)胞發(fā)揮著促炎和細(xì)胞毒性的作用，介導(dǎo)了胰島β細(xì)胞的破壞，推動(dòng)了糖尿病的發(fā)病。

圖2 不同組NOD小鼠脾臟和淋巴結(jié)中TFC（CXCR5+CD8+T細(xì)胞）和CXCR5-CD8+T細(xì)胞比例變化Figure 2 Changes in the proportion of TFC（CXCR5+CD8+T cells）and CXCR5-CD8+T cells in the spleen and lymph nodes of NOD mice of different groups

2.3 TFC 表達(dá)多種脫顆粒、抑制性標(biāo)記物，且標(biāo)記物表達(dá)水平均高于CXCR5-CD8+T細(xì)胞亞群

為進(jìn)一步探究TFC 的細(xì)胞表型以及其可能發(fā)揮的功能，根據(jù)在慢性感染和腫瘤中對TFC的既往研究成果，選取了表面標(biāo)記物CD107a、KLRG1、PD?1和TIM?3，對4、10、15、20、25 周及Hi 組NOD 小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞進(jìn)行流式染色分析。雖然CXCR5+CD8+T 細(xì)胞（即TFC）的細(xì)胞比例明顯低于CXCR5-CD8+T 細(xì)胞亞群，但通過檢測2 種細(xì)胞亞群表達(dá)的脫顆粒標(biāo)記物CD107a、KLRG1和抑制性分子PD?1、TIM?3，發(fā)現(xiàn)相較于CXCR5-CD8+T細(xì)胞亞群，TFC上的CD107a（4、10、20 周組，P＜0.05；15、25 周組、Hi組，P＜0.01，圖3A）、PD?1（15 周組、Hi 組，P＜0.05；25 周組，P＜0.01，圖3C）、TIM?3（15 周組，P＜0.05；25 周組、Hi 組，P＜0.01，圖3D）呈現(xiàn)明顯高表達(dá)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雖然KLRG1在2種細(xì)胞上均有表達(dá)，但KLRG1表達(dá)量僅在25周小鼠中有明顯差異（25周組，P＜0.01，圖3B）。這一結(jié)果印證了先前的推測，TFC 的脫顆粒分子呈高表達(dá)，表明這種細(xì)胞發(fā)揮的細(xì)胞毒性效應(yīng)顯著強(qiáng)于CXCR5-CD8+T 細(xì)胞。與此同時(shí)，TFC高表達(dá)PD?1和TIM?3，說明相較于CXCR5-CD8+T細(xì)胞，TFC具有顯著的“耗竭”表型。

圖3 TFC（CXCR5+CD8+T細(xì)胞）與CXCR5-CD8+T細(xì)胞亞群表達(dá)CD107a（A），KLRG1（B），PD?1（C）和TIM?3（D）標(biāo)記物的比例Figure 3 The levels of CD107a（A），KLRG1（B），PD?1（C）and TIM?3（D）markers expressed by TFC（CXCR5-CD8+ T cells）and CXCR5-CD8+T cell subsets

2.4 TFC 釋放IFN?γ和GzmB 的能力強(qiáng)于CXCR5-CD8+T細(xì)胞

在慢性感染和腫瘤中的研究表明，CXCR5+CD8+T細(xì)胞（即TFC）在面對病毒感染和腫瘤細(xì)胞侵襲時(shí)發(fā)揮著獨(dú)特的細(xì)胞毒性作用，前期研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，TFC 攜帶的脫顆粒分子CD107a呈高表達(dá)。為進(jìn)一步證實(shí)TFC在NOD小鼠中是否也發(fā)揮著強(qiáng)烈的細(xì)胞毒殺傷作用，我們將10周齡的NOD小鼠脾臟的淋巴細(xì)胞分離出來，經(jīng)PMA、Ionomycin、BFA處理后在5%CO2，37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中刺激5～6 h后，破膜進(jìn)行流式染色，檢測TFC及CXCR5-CD8+T細(xì)胞亞群中IFN?γ和GzmB的分泌水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TFC與CXCR5-CD8+T 細(xì)胞相比，具有更強(qiáng)地釋放GzmB（TFC：3.56%±2.1%；CXCR5-CD8+T 細(xì)胞：0.78%±0.39%，P＜0.05，圖4A）和IFN?γ（TFC：43.65%±12.25%；CXCR5-CD8+T 細(xì)胞：21.92%±3.72%，P＜0.05，圖4B）的能力。這一結(jié)果提示，TFC具有更強(qiáng)的促炎及細(xì)胞毒性作用，也進(jìn)一步證實(shí)了我們的猜想，TFC在自身免疫性糖尿病進(jìn)程中發(fā)揮著細(xì)胞毒性作用，破壞胰島β細(xì)胞，促進(jìn)疾病進(jìn)展。

3 討論

T1D 是由致病性T 細(xì)胞參與介導(dǎo)的針對胰島β細(xì)胞自身免疫性疾病。其免疫損傷的核心機(jī)制是，胰島自身抗原被抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）加工處理后遞呈給CD4+T細(xì)胞致其活化，活化的CD4+T 細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子的同時(shí)，活化并輔助CD8+T細(xì)胞殺傷破壞胰島β細(xì)胞。隨后胰島細(xì)胞內(nèi)抗原釋放并暴露，特異性B 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生胰島自身抗體。因此，CD8+T 細(xì)胞在T1D 的發(fā)病機(jī)制中起至關(guān)重要的作用，而阻止CD8+T 細(xì)胞進(jìn)行免疫攻擊成為T1D免疫治療的關(guān)鍵方向。

2007年，Quigley等［14］在人外周血和扁桃體B細(xì)胞的卵泡中發(fā)現(xiàn)了一群CXCR5+CD8+T細(xì)胞，起著早期效應(yīng)記憶性T細(xì)胞的作用。近些年，在對CXCR5+CD8+T細(xì)胞的不斷研究中，人們對這群細(xì)胞獨(dú)特的表型、功能、分化方式有了更加深入的了解［15］。在有關(guān)小鼠淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)膜腦膜炎病毒（latency of maximal pupil contraction velocity，LCMV）感染的研究中發(fā)現(xiàn)，有大量CXCR5+CD8+T 細(xì)胞進(jìn)入B 細(xì)胞濾泡，并且在免疫熒光顯微鏡下觀察到CXCR5 在小鼠刺激淋巴器官的濾泡和濾泡周CD8+T 細(xì)胞中表達(dá)［5，8，16］。因此，CXCR5+CD8+T細(xì)胞被稱為TFC。已有研究表明，TFC在健康人群外周血CD8+T細(xì)胞中約占2%［14］，并能夠浸潤分布于肺臟、胰腺和結(jié)直腸的腫瘤組織中，并且在腫瘤中的比例高于血液［11，17-18］。本項(xiàng)研究首先探索了TFC 在NOD 小鼠外周免疫器官的分布情況及比例，發(fā)現(xiàn)TFC 在脾臟和淋巴結(jié)中分布較高，占總CD8+T細(xì)胞比例的3%～10%，且在脾臟中的比例略高于淋巴結(jié)（P＞0.05）。而TFC在NOD小鼠胸腺中幾乎沒有表達(dá)。在具有免疫缺陷的人源化非肥胖糖尿病/合并嚴(yán)重免疫缺陷/白介素2受體γ鏈缺失小鼠（humanized non?obese diabetic/severe combined immune deficiency/interleukin?2 receptor γ?chain null，huNSG）中，TFC 在脾臟和淋巴結(jié)中約占10%［19］，本研究結(jié)果與之相似，這一結(jié)果也證實(shí)了TFC存在于NOD小鼠免疫器官內(nèi)，并有可能參與了自身免疫性糖尿病的進(jìn)程。

圖4 CXCR5+CD8+T細(xì)胞（即TFC）與CXCR5-CD8+T細(xì)胞釋放的GzmB（A）及IFN?γ（B）水平Figure 4 GzmB（A）and IFN?γ（B）levels released by CXCR5-CD8+T cells（TFC）and CXCR5-CD8+cell subsets

近年來，與TFC 相關(guān)的慢性感染及腫瘤研究已經(jīng)證實(shí)TFC 行使的3 大主要功能［15］：①發(fā)揮細(xì)胞毒作用，在B 細(xì)胞卵泡中進(jìn)行免疫監(jiān)視以消除感染的細(xì)胞和癌細(xì)胞，因此TFC 可以協(xié)助濾泡輔助性T 細(xì)胞（follicular helper T cells，Tfh）清除艾滋病病毒（hu?man immunodeficiency virus，HIV）［20］、猿猴免疫缺陷病毒（Simian immunodeficiency virus，SIV）感染［21-22］；②具有自我更新能力，能逆轉(zhuǎn)細(xì)胞“耗竭”狀態(tài)，面對長時(shí)間的抗原暴露（例如在慢性病毒感染或某些癌癥中）能夠維持細(xì)胞免疫力［5，8］；③具有雙向調(diào)節(jié)自身抗原抗體反應(yīng)的潛力［23-24］。為進(jìn)一步印證具有細(xì)胞毒性作用的TFC 參與了自身免疫糖尿病的自然進(jìn)程，檢測了4、10、15、20、25周及Hi組NOD小鼠的TFC 及CXCR5-CD8+T 細(xì)胞亞群的比例。研究結(jié)果顯示，無論在淋巴結(jié)還是在脾臟中，與CXCR5-CD8+T細(xì)胞相比，TFC的細(xì)胞比例明顯較低，并且在發(fā)病前隨著NOD小鼠周齡延長，TFC比例呈現(xiàn)逐漸增高趨勢，但是在NOD 小鼠發(fā)生高血糖后，TFC 比例出現(xiàn)下降。這一結(jié)果提示TFC 參與了NOD 小鼠的自然病程，并且在NOD小鼠免疫損傷不斷加重且發(fā)展為T1D 的過程中維持著越來越高的比例，以及持續(xù)性的浸潤。Insel 等［25］擬建了一個(gè)T1D 從疾病前狀態(tài)到發(fā)病的分期示意圖，該示意圖表示T1D 受遺傳和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的影響［26］，在尚未出現(xiàn)糖尿病癥狀但血糖已經(jīng)異常的情況下，β細(xì)胞自身抗原不斷暴露導(dǎo)致自身抗體的數(shù)量不斷增加。胰島β細(xì)胞受到免疫攻擊數(shù)量減少加之表位抗原與越來越多的抗體相結(jié)合，導(dǎo)致血糖升高后持續(xù)的抗原刺激減少，從而導(dǎo)致由持續(xù)性抗原刺激產(chǎn)生的TFC 的細(xì)胞比例下降，我們認(rèn)為這一過程能夠解釋高血糖組NOD小鼠無論在脾臟還是淋巴結(jié)中，TFC 的細(xì)胞比例均降低這一現(xiàn)象。

由于持續(xù)性的抗原暴露，抗原特異性CD8+T 細(xì)胞逐漸失去增殖、分泌細(xì)胞因子的能力，PD?1、TIM?3、淋巴細(xì)胞激活基因3（lymphocyte activation gene 3，LAG?3）、2B4（CD244）等抑制性受體的表達(dá)增加預(yù)示著細(xì)胞進(jìn)入“耗竭”狀態(tài)［27-28］。Im 等［16］研究表明，從LMCV 感染小鼠體內(nèi)分離出的CXCR5+CD8+T細(xì)胞（即TFC）表達(dá)低水平的抑制性分子，且這種減弱的“耗竭”表型更有利于控制病毒感染。本研究也對TFC 及CXCR5-CD8+T 細(xì)胞的脫顆粒標(biāo)記物CD107a、KLRG1 及免疫抑制性分子PD?1、TIM?3 的表達(dá)量進(jìn)行了分析。CD107a和KLRG1均是自然殺傷（natural killer cell，NK）細(xì)胞和活化的CD8+T 細(xì)胞脫顆粒的標(biāo)記物，已有研究表明這2 種分子通過釋放GzmB、IFN?γ和腫瘤壞死因子α等分子發(fā)揮其細(xì)胞毒性作用［29-31］。本研究結(jié)果顯示，脫顆粒標(biāo)記物CD107a 表達(dá)量在CXCR5-CD8+T 細(xì)胞群中幾乎無表達(dá)，而在TFC 中表達(dá)量顯著高于CXCR5-CD8+亞群，KLRG1在2種細(xì)胞中均有表達(dá)但比例在兩者間沒有顯著差異。與此同時(shí)，檢測了2 種細(xì)胞中IFN?γ和GzmB 的分泌水平，發(fā)現(xiàn)相較于CXCR5-CD8+T 細(xì)胞亞群而言，TFC具有更強(qiáng)的釋放GzmB和IFN?γ的能力。表達(dá)高水平的脫顆粒標(biāo)記物和高水平的IFN?γ和GzmB的分泌能力均提示著TFC具有更強(qiáng)的促炎及細(xì)胞毒性作用。KLRG1雖在TFC及CXCR5-CD8+T細(xì)胞均有表達(dá)，但其比例在2組細(xì)胞間沒有顯著差異，因此認(rèn)為KLRG1在T1D進(jìn)展中確實(shí)發(fā)揮了細(xì)胞毒性作用，但不是區(qū)分TFC與CXCR5-CD8+T細(xì)胞的標(biāo)志性表面分子。TIM?3是一種Ⅰ型膜表面蛋白分子，具有免疫球蛋白和黏蛋白樣結(jié)構(gòu)域。研究證實(shí)，阻斷TIM?3 途徑可以通過上調(diào)輔助性T 細(xì)胞1（T helper cell 1，Th1）依賴性免疫應(yīng)答，抑制免疫耐受，促進(jìn)NOD 小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)展［32?33］。同樣的，PD?1作為目前腫瘤免疫檢查點(diǎn)療法中炙手可熱的靶點(diǎn)，其PD?1/PD?1 配體通路的阻斷一方面能減輕腫瘤中的T 細(xì)胞浸潤，另一方面則會(huì)引起胰島白細(xì)胞浸潤促進(jìn)自身免疫性糖尿病的發(fā)展［34-35］。本研究中NOD 小鼠脾臟TFC表面抑制性分子PD?1和TIM?3的表達(dá)水平明顯高于CXCR5-CD8+亞群，這一結(jié)果與前面提到的研究結(jié)果相一致，意味著TFC 在NOD 小鼠自身免疫性糖尿病自然病程中也攜帶著這種“耗竭”表型。但是在T1D疾病進(jìn)程中，到底是脫顆粒標(biāo)記物發(fā)揮的細(xì)胞毒性作用強(qiáng)還是抑制性分子的“耗竭”表型占主導(dǎo)還需進(jìn)一步探究，TFC作用途徑的探究將為T1D 免疫檢查點(diǎn)封鎖療法提供新思路。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TFC存在于NOD小鼠脾臟和淋巴結(jié)中，胸腺中幾乎不分布。在發(fā)生高血糖前，其比例隨著NOD 小鼠免疫損傷進(jìn)展而不斷增高，而一旦發(fā)病，TFC 比例出現(xiàn)下降。相較于CX?CR5-CD8+T細(xì)胞，其脫顆粒標(biāo)志物CD107a呈顯著性高表達(dá)，同時(shí)TFC 釋放IFN?γ和GzmB 能力強(qiáng)，均提示著TFC參與了T1D的自然病程且通過細(xì)胞毒性作用促進(jìn)NOD 小鼠的免疫損傷。TFC 的抑制性分子PD?1、TIM?3呈現(xiàn)高表達(dá)，說明TFC這種細(xì)胞攜帶著“耗竭”表型。在未來的研究中，將進(jìn)一步完善TFC相關(guān)功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，并且探索TFC 細(xì)胞在T1D 患者中的分布情況及作用機(jī)制，從而進(jìn)一步探尋TFC 與T1D的關(guān)聯(lián)。