李珺晗，邱 銘，陸 艷，孫 偉，孔祥清

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，江蘇 南京 210029

血管鈣化是高血壓、慢性腎病、血管損傷、糖尿病血管病變和衰老等過程中廣泛存在的一種病理性血管重構(gòu)，是導(dǎo)致心腦血管疾病高病死率的重要因素之一。眾多研究表明血管鈣化是一個(gè)與骨形成相似的主動(dòng)性、可調(diào)控的異位成骨樣分化和鈣磷沉積過程。在血管組織中，間質(zhì)細(xì)胞包括血管平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞是發(fā)生鈣化的主要細(xì)胞，它們在各種致病因素的作用下發(fā)生成骨樣分化和鈣磷含量增加，構(gòu)成了血管鈣化尤其是血管中膜、外膜鈣化的主要細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)［1］。由于鈣化的機(jī)制復(fù)雜，目前實(shí)際診療中尚沒有有效的治療藥物。近年來研究表明，低強(qiáng)度脈沖超聲（low intensity pulsed ul?trasound，LIPUS）對機(jī)體的細(xì)胞和組織具有非滅活性生物學(xué)效應(yīng)。例如LIPUS可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的成血管功能［2］，促進(jìn)骨折愈合等［3］。但LIPUS能否改善血管鈣化尚沒有研究報(bào)道。本研究擬通過研究LIPUS 對細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)，探索其抑制血管鈣化的效果。

1 材料和方法

1.1 材料

大鼠平滑肌細(xì)胞、大鼠成纖維細(xì)胞來源于南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場，配制鈣化培養(yǎng)基：DMEM（含HEPES）高糖培養(yǎng)基，含1%胎牛血清（FBS）、1%青/鏈霉素、2 mmol/L 磷酸鹽（Pi）、1.5 mmol/L 鈣鹽（Ca）。使用的一抗：GAPDH抗體（#5174）、RUNX2 抗體（#12556）（Cell Signaling Tech?nology 公司，美國），OPN 抗體（#BS1264）（Bioworld Technology公司，美國），HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗（Cell Signaling Technology 公司，美國）。顯影液（SuperSignalTMWest Femto Maximum Sensitivi?ty Substrate，Thermo 公司，美國），ChemiDoc XRS 成像系（Bio?Rad 公司，美國）。南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物保護(hù)及使用委員會(huì)批準(zhǔn)了所有動(dòng)物協(xié)議。所有涉及動(dòng)物的程序均按照美國國立衛(wèi)生研究院出版的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》（no.85?23；1996年修訂）進(jìn)行，研究方案獲得了南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)的批準(zhǔn)（IACUC?1906038）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

茜素紅染色、鈣濃度測定和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性測定分為6 組，包括空白對照組（Ctrl）、高鈣磷處理組（HCa+Pi）、92 mW/cm2聲強(qiáng)LIPUS 處理組（92 mW/cm2LIPUS）、14 mW/cm2聲強(qiáng)LIPUS+高鈣磷處理組（14 mW/cm2LIPUS+HCa+Pi）、44 mW/cm2聲強(qiáng)LIPUS+高鈣磷處理組（44 mW/cm2LIPUS+HCa+Pi）、92 mW/cm2聲強(qiáng)LIPUS+高鈣磷處理組（92 mW/cm2LIPUS+HCa+Pi）。Western blot、real?time PCR 實(shí)驗(yàn)分為4組，包括空白對照組（Ctrl）、高鈣磷處理組（HCa+Pi）、14 mW/cm2聲強(qiáng)LIPUS 處理組（14 mW/cm2LIPUS）、14 mW/cm2聲強(qiáng)LIPUS+高鈣磷處理組（14 mW/cm2LIPUS+HCa+Pi）。

1.2.2 大鼠平滑肌細(xì)胞（rat vascular smooth muscle cell，rVSMC）和成纖維細(xì)胞（rat vascular adventitial fibroblast，rVAF）的提取

rVAF 的提?。簩? 只健康雄性清潔級SD 大鼠（180～200 g）麻醉后，在無菌條件下取出大鼠的胸主動(dòng)脈，放入預(yù)冷無菌PBS中暫存。配置1 200 U/mL膠原酶消化液，抗生素梯度清洗血管后，轉(zhuǎn)入放有膠原酶消化液的皿中，搖床消化30 min（37 ℃、轉(zhuǎn)速45 r/min）。用顯微器械在體式顯微鏡下分離主動(dòng)脈外膜，將外膜轉(zhuǎn)入加了膠原酶的消化液中，放入搖床消化1 h（37 ℃、轉(zhuǎn)速120 r/min），離心棄上清，加入含10%FBS的DMEM新鮮完全培養(yǎng)基，用100 μm濾網(wǎng)過濾后轉(zhuǎn)入25 cm2培養(yǎng)瓶中于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h 觀察貼壁后換培養(yǎng)基。細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，選取第3 代至第5 代的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

rVSMC 的提?。嚎股靥荻惹逑此喝ネ饽さ难?，將血管轉(zhuǎn)入含有20%FBS的DMEM 新鮮完全培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜。18 h 后將沿血管縱軸剪開，鈍物刮除內(nèi)膜，將血管剪碎后，轉(zhuǎn)入膠原酶消化液中，放入搖床消化2 h（37 ℃、轉(zhuǎn)速50 r/min），棄上清，加有20%FBS 的DMEM 新鮮完全培養(yǎng)基，用100 μm濾網(wǎng)過濾后轉(zhuǎn)入25 cm2培養(yǎng)瓶中37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h觀察貼壁后換培養(yǎng)基。細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，選取第3代至第5代的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 體外誘導(dǎo)rVCMC和rVAF鈣化模型的構(gòu)建

用生理鹽水溶解鈣、磷后加入DMEM 培養(yǎng)基中，使磷的終濃度達(dá)到2 mmol/L，鈣的終濃度達(dá)到1.5 mmol/L，使用高鈣磷鈣化培養(yǎng)基處理rVSMC 和rVAF72 h。

1.2.4 體外細(xì)胞模型中低強(qiáng)度脈沖超聲處理

低強(qiáng)度脈沖超聲刺激是利用一組超聲設(shè)備進(jìn)行的，包括信號發(fā)生器（安捷倫科技有限公司，美國）、寬帶功率放大器（羅切斯特電子創(chuàng)新有限公司，美國）和平面換能器（重慶海福）。平面換能器頻率為1 MHz，通過改變電壓和刺激周期來施加不同的LI?PUS 強(qiáng)度處理（以聲強(qiáng)mW/cm2表示）。選擇14、44、92 mW/cm23種不同的聲強(qiáng)，將傳感器（直徑6 cm）置于水缸中，將細(xì)胞培養(yǎng)皿的底部放入傳感器中，注入脫氣水。細(xì)胞懸液暴露于LIPUS 刺激5 min（LIPUS 組），而對照不進(jìn)行LIPUS 刺激。在超聲波處理過程中，培養(yǎng)皿中細(xì)胞培養(yǎng)基的溫度不超過37 ℃。

1.2.5 細(xì)胞鈣濃度測定

吸去培養(yǎng)基后，用PBS將12孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞清洗3次，每孔加入500 μL 0.6 mol/L鹽酸對細(xì)胞進(jìn)行脫鈣處理，放入4 ℃搖床，24 h 后收集并進(jìn)行檢測。使用試劑盒：QuantiChromTMCalcium Assay Kit（DICA 500，QuantiChrom 公司，美國）。取5 μL樣品加入96 孔板，加入200 μL 工作液，室溫振蕩3 min后使用SynergyTM2 microplate reader（BioTek 公司，美國）讀取612 nm 處吸光度。將12 孔板中液體吸凈，預(yù)冷PBS 沖洗3 次后加入0.1%SDS 或0.1 mol/L NaOH 裂解細(xì)胞，收集后離心（4 ℃、13 000g）20 min并吸取上清，使用BCA 法測蛋白濃度（BCA Protein Assay kit，Thermo Scientific Pierce 公司，美國）。鈣濃度值計(jì)算：標(biāo)準(zhǔn)化鈣濃度（μg/mg protein）=絕對鈣濃度/蛋白濃度。

1.2.6 ALP活性測定

吸去培養(yǎng)基后，用PBS 將12 孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞清洗3 次；每孔加入250 μL 0.05 %的曲拉通X?100 裂解細(xì)胞，3 次凍融后收集孔中液體，離心（4 ℃、15 000 r/min）15 min 后吸上清液作為樣品。使用ALP 試劑盒（WAKO 公司，日本）。做標(biāo)準(zhǔn)曲線，將100 μL 底物和20 μL 樣品加入96 孔板，振蕩1 min 后37 ℃孵育15 min；添加80 μL 反應(yīng)終止液，充分振蕩1 min 后，用SynergyTM2 micro plate reader（BioTek 公司，美國）測量405 nm處的吸光度值。同法測定空白對照和標(biāo)準(zhǔn)品。BCA 法檢測樣品的總蛋白濃度，根據(jù)公式C×a/（t×M）計(jì)算ALP 活性。C：由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的吸光度值（實(shí)驗(yàn)值與空白值的差值）；t：反應(yīng)時(shí)間（min）；M：樣品的總蛋白濃度；a：樣品的稀釋倍數(shù)。

1.2.7 茜素紅染色

吸取12 孔板中培養(yǎng)基，PBS 漂洗3 次；4%甲醛溶液固定10 min 后用PBS 漂洗3 次；95%乙醇固定20～30 min，去離子水洗滌3 遍；2%茜素紅S 染色1 min，顯微鏡下觀察橘紅色結(jié)節(jié)的情況；去離子水洗滌數(shù)次至無非特異性染色，使用掃描儀掃描圖像。

1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用RNeasy RNA isolation kit（Qiagen 公司，美國）提 取rVAF、rVSMC 的 總RNA，使 用Prime?ScriptTMRT re?agent Kit（TaKaRa 公司，日本）進(jìn)行cDNA 合成。引物RUNX2：正向引物5′?TCTCA?GATCGTTGAACCTTGCTA?3′，反向引物5′?TGGT?TACTGTCATGGCGGGTA?3′；OPN：正向引物5′?GA?CACGAAGGTAAAGGTGAC?3′，反向引物5′?CTG?GTGCTCGTCCTCTACTAC?3′；通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Prism 7900，ABI 公司，美國）系統(tǒng)進(jìn)行檢測。所有熒光定量PCR反應(yīng)均重復(fù)3次，用GAPDH將目標(biāo)基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。按照對照組將CT值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，計(jì)算各組CT值的變化。

1.2.9 Western blot

將各組細(xì)胞用PBS 漂洗2 次，根據(jù)Cytoplasmic Extraction Reagents（Thermo 公司，美國）試劑盒提取細(xì)胞蛋白，并在-70 ℃下保存至直使用。蛋白產(chǎn)物經(jīng)10%～15%的SDS 聚丙烯酰胺凝膠分離后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜（Roche 公司，瑞士）上，5%BSA 溶液封閉后孵育一抗，后孵育相對應(yīng)的HRP 偶聯(lián)二抗（1∶5 000稀釋）。使用一抗：GAPDH抗體（#5174）、RUNX2抗體（#12556）、OPN抗體（#BS1264）［4］，使用二抗：HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗。使用顯影液反應(yīng)1 min 后，在ChemiDoc XRS 成像系統(tǒng)下曝光。Image Lab?軟件用于條帶灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（）。兩組比較選擇t檢驗(yàn)，4組數(shù)據(jù)選擇單因素方差分析和Bonferroni多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LIPUS對rVSMC鈣化的影響

分別應(yīng)用14、44、92 mW/cm23個(gè)聲強(qiáng)LIPUS 輻照rVSMC 1 次（5 min）后，給予高鈣磷培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，結(jié)果顯示，茜素紅染色顯示14～92 mW/cm2的LIPUS 預(yù)處理組細(xì)胞鈣沉積顯著低于對照組，以14 mW/cm2最為顯著（圖1A）。14～92 mW/cm2的LI?PUS 處理組與高鈣磷處理組比較，細(xì)胞內(nèi)鈣含量明顯降低（P＜0.001，圖1B）。ALP 活性結(jié)果表明高鈣磷處理顯著增加了rVSMC 的ALP 活性，而LIPUS 處理組與高鈣磷處理組相比，降低了細(xì)胞內(nèi)ALP活性（P＜0.001，圖1C）。

圖1 不同聲強(qiáng)低強(qiáng)度脈沖超聲在大鼠rVSMC的抗鈣化作用Figure 1 The protective effect of low intensity pulsed ultrasound with different intensity on calcification in rVSMV

2.2 LIPUS對rVAF鈣化的影響

分別應(yīng)用14、44、92 mW/cm23個(gè)聲強(qiáng)LIPUS 輻照rVAF 1 次（5 min）后，給予高鈣磷培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，茜素紅染色顯示14、44 mW/cm2的LIPUS 預(yù)處理組細(xì)胞鈣沉積顯著低于對照組，92 mW/cm2有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2A）。14～92 mW/cm2的LIPUS 處理組與高鈣磷處理組比較，細(xì)胞內(nèi)鈣含量明顯降低（P＜0.01，圖2B）。ALP 活性結(jié)果表明高鈣磷處理顯著增加了rVAF的ALP活性，而LIPUS處理組與高鈣磷處理組相比，降低了細(xì)胞內(nèi)ALP活性（P＜0.001，圖2C）。

圖2 不同聲強(qiáng)低強(qiáng)度脈沖超聲在大鼠rVAF的抗鈣化作用Figure 2 The protective effect of low intensity pulsed ultrasound with different intensity on calcification in rVAF

2.3 LIPUS 抑制血管平滑肌細(xì)胞、血管成纖維細(xì)胞的成骨分化

Western blot 和real?time PCR 結(jié)果顯示，高磷鈣培養(yǎng)基顯著增加了rVSMC 和rVAF 成骨分化指標(biāo)RUNX2 和OPN的表達(dá)。14 mW/cm2LIPUS 處理抑制了高磷鈣處理組的RUNX2 和OPN 蛋白高表達(dá)，表明其發(fā)揮了抗鈣化的保護(hù)作用（圖3）。

圖3 低強(qiáng)度脈沖超聲對成骨分化的抑制作用Figure 3 The inhibition of low intensity pulsed ultrasound on osteogenic differentiation

3 討論

臨床上促進(jìn)血管鈣化發(fā)生發(fā)展的因素主要有高血壓、糖尿病、腎功能不全和吸煙等，其中尤其以慢性腎病引起的鈣磷代謝紊亂所致的血管鈣化后果最為嚴(yán)重，主要好發(fā)于中青年人群，是導(dǎo)致此類患者死亡的重要原因之一。慢性腎病相關(guān)的血管鈣化主要表現(xiàn)為彌漫性血管中膜鈣化，導(dǎo)致血管彈性喪失，從而引起頑固性血壓升高和致死性出血等嚴(yán)重并發(fā)癥［5］，動(dòng)脈鈣化程度也被認(rèn)為是影響慢性腎病患者預(yù)后的最佳血管指標(biāo)之一［6］。血管鈣化最終表現(xiàn)為鈣磷結(jié)晶在動(dòng)脈管壁上的沉積，組織內(nèi)鈣磷水平的失衡是血管鈣化形成的核心環(huán)節(jié)，血清和局部組織內(nèi)異常升高的鈣磷水平促進(jìn)血管間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生成骨分化、細(xì)胞凋亡等，導(dǎo)致羥基磷灰石結(jié)晶的形成和發(fā)展［7］。而迄今為止，由于對血管鈣化的機(jī)制尚不完全清楚，臨床上缺乏有效的防治血管鈣化的方法。因此，關(guān)注血管鈣化，尤其是加強(qiáng)對血管鈣化病理機(jī)制和干預(yù)方法的研究對于提高對人體內(nèi)血管穩(wěn)態(tài)的深入理解，降低心腦血管嚴(yán)重并發(fā)癥和病死率具有重要意義。

超聲波應(yīng)用于臨床診斷已有50年的歷史，診斷性超聲由于其聲波頻率高、功率低，短時(shí)間內(nèi)對人體組織不會(huì)產(chǎn)生明顯影響。與診斷超聲相比，治療性超聲在臨床的應(yīng)用也有近30年的歷史，其中體外沖擊波超聲最先應(yīng)用于泌尿系結(jié)石的治療［8］，近10年高強(qiáng)度聚焦超聲也被用于腫瘤組織的消融［9］，這兩種方式的治療原理都是通過高功率的超聲能量作用與局部組織，產(chǎn)生損毀式效應(yīng)，達(dá)到碎石和腫瘤組織滅活的效應(yīng)。LIPUS 是一種特殊類型的超聲，它具有熱效應(yīng)小、強(qiáng)度低等特點(diǎn)，同時(shí)能把聲能傳輸?shù)桨薪M織，能夠?yàn)橹委煈?yīng)用提供非侵入性物理刺激［10］。已有研究表明，LIPUS 對多種細(xì)胞具有生物學(xué)效應(yīng)，包括增加細(xì)胞膜滲透性［11］，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡［12-13］、增殖［14］、分化［15］和遷移［16］。那么在高鈣磷誘導(dǎo)的rVSMC和rVAF的鈣化中，LIPUS是否也可以發(fā)揮抑制血管鈣化的作用，減少血管鈣鹽沉積？從本研究結(jié)果可以看出，LIPUS 顯著降低了高鈣磷誘導(dǎo)的rVSMC 和rVAF 內(nèi)的鈣含量，抑制了ALP 活性的增高，同時(shí)其鈣沉積也顯著下降。Western blot實(shí)驗(yàn)和real?time PCR 結(jié)果都顯示LIPUS 組中，RUNX2 和OPN的表達(dá)顯著降低。

綜上所述，LIPUS 可以顯著抑制高鈣磷誘導(dǎo)的rVSMC和rVAF的鈣化，通過抑制RUNX2的表達(dá)，緩解了rVSMC 和rVAF 的成骨分化過程，減少了細(xì)胞鈣沉積。這一發(fā)現(xiàn)也將為臨床開辟治療血管鈣化提供新思路。