彭明玉，何慶玲，王文博，趙 聃，張 婧，王迎偉，邱 文

南京醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系，江蘇 南京 211166

大鼠Thy?1 腎炎（Thy?1 nephritis，Thy?1N）是一種公認(rèn)的研究人類系膜增生性腎小球腎炎（mesan?gial proliferative glomerulonephritis，MsPGN）的動(dòng)物模型［1-2］，給大鼠注射抗Thy?1抗原的抗體后，該抗體能與大鼠腎小球系膜細(xì)胞（glomerular mesangial cells，GMC）表面的Thy?1抗原結(jié)合，繼而激活補(bǔ)體，引起炎癥反應(yīng)和GMC 增生病變。已知補(bǔ)體作用靶細(xì)胞可分為全溶解型（lytic）和亞溶解型（sublytic），sublytic C5b?9 雖不能導(dǎo)致細(xì)胞溶破，但能促發(fā)多種生物學(xué)反應(yīng)［3］。本課題組以往研究證實(shí)，Thy?1N 病變具有補(bǔ)體C5b?9 依賴性，尤其是sublytic C5b?9 依賴性。Thy?1N大鼠腎組織內(nèi)和體外受sublytic C5b?9刺激的大鼠GMC 中，多種炎癥因子如白介素（inter?leukein，IL）?6、IL?23和IL?36a表達(dá)顯著上調(diào)，且參與腎組織炎性病變［4-9］。但是，其他炎癥因子或介質(zhì)在Thy?1N發(fā)病過程中發(fā)揮何種作用目前尚不知曉。

本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Thy?1N大鼠腎組織中和體外受sublytic C5b?9刺激的大鼠GMC中，炎癥介質(zhì)S100A8 的mRNA 和蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)。S100蛋白家族是僅存在于脊椎動(dòng)物中的低分子量蛋白［10］，于1965年由Moore 等［11］在牛腦中首次發(fā)現(xiàn)，因其可100%溶于飽和硫酸銨而得名。S100 蛋白家族共計(jì)20 余個(gè)成員，包括S100A1?A18、S100B、S100P等［12-13］，且具有組織和細(xì)胞特異性以及結(jié)合Ca2+的能力［12］。在損傷或應(yīng)激等因素的作用下，S100蛋白被釋放到細(xì)胞外，促發(fā)組織炎癥反應(yīng)［13］。已發(fā)現(xiàn)，S100 在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）、炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）和狼瘡腎炎（lupus nephritis，LN）等免疫性疾病中發(fā)揮了重要的促炎作用［14］。另有研究報(bào)道，在心肌梗死后發(fā)生的炎癥中，梗死灶中的中性粒細(xì)胞釋放的S100A8可與TLR?4結(jié)合，促進(jìn)NLRP3炎癥小體釋放IL?1β，后者可增強(qiáng)骨髓中粒細(xì)胞的分化，進(jìn)而加重炎癥反應(yīng)［15］。

為了研究Thy?1N 大鼠GMC 中S100A8 基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，本課題組前期又篩查了Thy?1N大鼠腎組織內(nèi)和體外受sublytic C5b?9 刺激的大鼠GMC中上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)性別決定區(qū)Y框蛋白7（SRY?related HMG?box gene 7，SOX7）的mRNA 和蛋白表達(dá)均顯著上升（資料未發(fā)表）。SOX7是一種含有高遷移率族框結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，可與啟動(dòng)子區(qū)DNA序列結(jié)合啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。目前發(fā)現(xiàn)的SOX 家族根據(jù)HMG 結(jié)構(gòu)的氨基酸序列分為A、B1、B2、C、D、E、F、G 和H 亞群，共20余個(gè)成員，其中SOX7屬于F亞群［16-17］。有文獻(xiàn)報(bào)道，SOX7 作為抑癌基因可通過Wnt/β?catenin 信號(hào)通路抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖［16］。此外，SOX7 還可通過Notch信號(hào)通路促進(jìn)血管生成［18］。本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在大鼠GMC 中過表達(dá)SOX7 可上調(diào)S100A8基因的表達(dá)（資料未發(fā)表），另生物信息學(xué)軟件預(yù)測提示大鼠S100A8 基因啟動(dòng)子區(qū)含有SOX7的結(jié)合元件，但是上調(diào)的SOX7 能否直接促進(jìn)S100A8 基因的轉(zhuǎn)錄，目前尚不清楚，故本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)此問題展開研究。首先構(gòu)建大鼠S100A8 基因啟動(dòng)子全長和截短質(zhì)粒，與大鼠S100A8過表達(dá)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK?293T 工具細(xì)胞，觀察SOX7 對(duì)S100A8 基因啟動(dòng)子活性的影響，同時(shí)篩選SOX7 與S100A8 基因可能的結(jié)合元件，并對(duì)上述SOX7 結(jié)合元件進(jìn)行突變分析，擬為進(jìn)一步研究Thy?1N 大鼠GMC 中SOX7促進(jìn)S100A8基因啟動(dòng)和轉(zhuǎn)錄的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚腎293T（HEK?293T）細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）。pGL3?basic 和pRL?SV40 熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒以及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒（Promega 公司，美國）；基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化技術(shù)有限）；SanPrep 柱式PCR 產(chǎn)物純化試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）；高保真酶PrimeSTAR@Max DNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、SmaⅠ和T4 DNA連接酶（TaKaRa公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

登錄NCBI，通過Gene 數(shù)據(jù)庫中搜索大鼠S100A8 基因（ID：116547），利用Primer 5.0 軟件輔助設(shè)計(jì)針對(duì)S100A8基因啟動(dòng)子區(qū)（-2 068～+174 nt）的引物，上游：5′?GGGGTACCATCCTAGCAGATGT?GAGATGG?3′；下游：5′?TCCCCCGGGGCTACTC?TATTCCCCCAACTC?3′，并在上下游引物序列前加入KpnⅠ、SmaⅠ酶切位點(diǎn)序列，后交由滁州通用生物系統(tǒng)有限公司制備。

1.2.2 大鼠S100A8基因啟動(dòng)子全長序列的擴(kuò)增

以大鼠基因組DNA 為模板，用PrimeSTAR@Max DNA Polymerase 進(jìn)行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系：PrimeSTAR Max Premix（2×）25 μL，上、下游引物各2 μL，基因組DNA 2 μL，滅菌雙蒸水19 μL；反應(yīng)程序：98 ℃變性10 s；60 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，循環(huán)30 次；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SanPrep 柱式PCR 產(chǎn)物純化試劑盒回收。

1.2.3 大鼠S100A8 基因啟動(dòng)子全長熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將pGL3?basic 質(zhì)粒與S100A8 基因啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物與限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和SmaⅠ37 ℃水浴2 h，利用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒分別回收線性化的pGL3?basic質(zhì)粒和S100A8啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物，再通過T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)（16 ℃，8～12 h），并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，將其均勻涂布于含Amp 抗性的LB 平板瓊脂表面，于37 ℃中培養(yǎng)12 h 后，挑取5 個(gè)單克隆菌落于3 mL 含有Amp 抗性的液體LB 培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)12 h。取1 μL 培養(yǎng)后的菌液作為模板DNA 進(jìn)行PCR 鑒定，篩選出的陽性克隆送通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司測序鑒定，將構(gòu)建成功的質(zhì)粒命名為pGL3?S100A8?FL。

1.2.4 大鼠S100A8 基因啟動(dòng)子截短和突變質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

利用JASPAR 軟件預(yù)測S100A8 基因啟動(dòng)子區(qū)SOX7 的結(jié)合元件，并根據(jù)預(yù)測結(jié)果通過通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司構(gòu)建4 個(gè)S100A8 基因啟動(dòng)子截短質(zhì)粒。后由該公司將S100A8基因啟動(dòng)子-86～-57 nt 區(qū)SOX7 結(jié)合元件5′?GAAATGCTCAATGT?GCTCAGTGATTGCCAC?3′突變?yōu)?′?GGGCGCGC?GCGCTATAGGGCGCGCGCGCCC?3′，突變質(zhì)粒命名為pGL3?S100A8?M。

1.2.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK?293T細(xì)胞

將HEK?293T細(xì)胞接種于24孔板中（1×105個(gè)/孔），培養(yǎng)24 h 后，用Lipofectamine 2000 將pIRES2?SOX7、pRL?SV40分別與S100A8基因啟動(dòng)子全長質(zhì)粒及各截短質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK?293T細(xì)胞。

1.2.6 熒光素酶活性的測定

待上述質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK?293T 細(xì)胞48 h 后，用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒中PLB 裂解液稀釋后裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解產(chǎn)物，分別檢測S100A8 基因啟動(dòng)子質(zhì)粒及內(nèi)參照質(zhì)粒（pRL?SV40）的熒光活性，其中，目的基因的螢火蟲熒光素酶活性（M1）/pRL?SV40 質(zhì)粒的海腎熒光素酶活性（M2），即為被檢測質(zhì)粒的相對(duì)熒光素酶活性（RLU）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得定量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（）表示。采用SPSS 19.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和Bonfferoni法兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠S100A8啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

PCR 擴(kuò)增大鼠S100A8 全長啟動(dòng)子（-2 068～+174 nt）后，經(jīng)雙酶切插入pGL3?basic 質(zhì)粒中，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后均勻涂布于含Amp抗性的固體LB平板瓊脂表面，經(jīng)菌液PCR 篩選出陽性克隆菌落，再送公司測序驗(yàn)證，測序結(jié)果顯示質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pGL3?S100A8?FL（圖1）。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Figure 1 Agarose gel electrophoresis results

2.2 過表達(dá)SOX7 對(duì)大鼠S100A8 啟動(dòng)子全長活性的影響

將pIRES2?EGFP、pIRES2?SOX7、pRL?SV40 和pGL3?S100A8?FL 不同分組共轉(zhuǎn)染HEK?293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h 檢查GFP 表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)GFP 顯著表達(dá)，其轉(zhuǎn)染效率約為80%（圖2）。隨后裂解細(xì)胞并進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因檢測，結(jié)果顯示，pGL3?S100A8?FL、pIRES2?SOX7 與pRL?SV40 共轉(zhuǎn)染組其RLU值顯著高于pGL3?S100A8?FL、pIRES2?EGFP與pRL?SV40 共轉(zhuǎn)染組，提示SOX7 過表達(dá)能夠明顯上調(diào)S100A8基因的啟動(dòng)子活性。

2.3 SOX7 過表達(dá)對(duì)大鼠S100A8 基因啟動(dòng)子活性的影響

2.3.1 大鼠S100A8 基因啟動(dòng)子各截短質(zhì)粒位置的確定

應(yīng)用生物信息學(xué)軟件JASPAR 對(duì)S100A8 基因啟動(dòng)子全長序列中SOX7 的結(jié)合元件進(jìn)行預(yù)測（表1）。參考其各結(jié)合元件的位置，設(shè)計(jì)相應(yīng)的截短質(zhì)粒（表2）。

2.3.2 大鼠S100A8 基因啟動(dòng)子各截短質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

基于pGL3?S100A8?FL 質(zhì)粒，由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司構(gòu)建上述4 個(gè)截短質(zhì)粒，即pGL3?S100A8?1、pGL3?S100A8?2、pGL3?S100A8?3和pGL3?S100A8?4，測序結(jié)果顯示pGL3?S100A8?1～4 截短質(zhì)粒構(gòu)建正確。

2.3.3 SOX7過表達(dá)對(duì)大鼠S100A8基因啟動(dòng)子各截短質(zhì)?；钚缘挠绊?/p>

將pGL3?basic、pGL3?S100A8?FL 和pGL3?S100A8 各截短質(zhì)粒分別與pIRES2?SOX7 和pRL?SV40共轉(zhuǎn)染HEK?293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h裂解細(xì)胞并測定其熒光素酶活性，轉(zhuǎn)染pGL3?S100A8?4 細(xì)胞的RLU 值較pGL3?S100A8?FL 和pGL3?S100A8?1～3 轉(zhuǎn)染組相比顯著降低（圖3）。提示S100A8基因啟動(dòng)子區(qū)的SOX7結(jié)合元件可能位于-200～+51 nt區(qū)域。

2.3.4 SOX7過表達(dá)對(duì)大鼠S100A8基因啟動(dòng)子突變質(zhì)?；钚缘挠绊?/p>

為了進(jìn)一步確定SOX7在S100A8啟動(dòng)子-200～+51 nt區(qū)內(nèi)的結(jié)合元件，根據(jù)JASPAR結(jié)合元件預(yù)測結(jié)果，又開展了啟動(dòng)子突變實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建了S100A8 啟動(dòng)子-86～-57 nt 區(qū)突變的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，即將5′?GAAATGCTCAATGTGCTCAGTGATTGCCAC?3′突變?yōu)?′?GGGCGCGCGCGCTATAGGGCGCGCGC?GCCC?3′，并將其命名為pGL3?S100A8?FL?M。將pGL3?basic、pGL3?S100A8?FL和pGL3?S100A8?M分別與pIRES2?SOX7質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK?293T細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染48 h裂解細(xì)胞并檢測各組熒光素酶活性。結(jié)果顯示，S100A8基因全長啟動(dòng)子-86～-57 nt突變后其熒光素酶活性顯著降低，初步確定轉(zhuǎn)錄因子SOX7可通過與-86～-57 nt區(qū)結(jié)合并上調(diào)S100A8的啟動(dòng)子活性（圖4）。

圖2 HEK?293T細(xì)胞中質(zhì)粒共轉(zhuǎn)效率的評(píng)估以及SOX7過表達(dá)對(duì)大鼠S100A8基因啟動(dòng)子全長熒光素酶活性的影響Figure 2 Transfection efficiency of plasmids in HEK?293T cells and the effect of SOX7 overexpres?sion on rat S100A8 gene full?length promoter activity

表1 JASPAR 預(yù)測的大鼠S100A8 基因啟動(dòng)子區(qū)SOX7 結(jié)合元件Table 1 SOX7 binding elements within rat S100A8 gene promoter predicted by JASPAR

表2 S100A8截短質(zhì)粒位置Table 2 location of different S100A8 truncated luciferase reporter plasmids

圖3 HEK?293T 細(xì)胞中SOX7 對(duì)S100A8 各截短質(zhì)粒熒光素酶活性的影響Figure 3 The effect of SOX7 on the activity of different truncated rat S100A8 promoter in HEK?293T cells

3 討論

本課題組前期研究證實(shí)，大鼠Thy?1N發(fā)病過程中炎癥介質(zhì)S100A8 和轉(zhuǎn)錄因子SOX7 的表達(dá)均顯著上調(diào)，且體外用sublytic C5b?9刺激大鼠GMC后亦可明顯增強(qiáng)S100A8 和SOX7 的表達(dá)。此外，在大鼠GMC中過表達(dá)SOX7可顯著上調(diào)S100A8的表達(dá)，另生物信息學(xué)軟件預(yù)測提示，S100A8基因啟動(dòng)子區(qū)包含多個(gè)SOX7 結(jié)合元件。因此推測，sublytic C5b?9刺激大鼠GMC 后可通過上調(diào)SOX7 促進(jìn)S100A8 基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而加重Thy?1N的炎性病變。

為了研究大鼠SOX7 對(duì)S100A8 基因啟動(dòng)的影響，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了大鼠S100A8基因啟動(dòng)子全長熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（pGL3?S100A8?FL），將pGL3?S100A8?FL質(zhì)粒與我們前期構(gòu)建的pIRES2?SOX7質(zhì)粒行不同分組共轉(zhuǎn)染HEK?293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h裂解細(xì)胞并測定其熒光素酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pGL3?S100A8?FL和pIRES2?SOX7共轉(zhuǎn)染組其熒光素酶活性顯著高于其他組，提示過表達(dá)大鼠SOX7能夠增強(qiáng)HEK?293T細(xì)胞中大鼠S100A8基因的啟動(dòng)子活性，這一發(fā)現(xiàn)與本課題前期GMC 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致，即轉(zhuǎn)錄因子SOX7能夠促進(jìn)大鼠GMC中S100A8基因的表達(dá)。

圖4 HEK?293T 細(xì)胞中SOX7 對(duì)S100A8 全長和突變啟動(dòng)子質(zhì)粒熒光素酶活性的影響Figure 4 The effect of SOX7 on the activity of full length and mutant of rat S100A8 promoter in HEK?293T cells

為了進(jìn)一步確定大鼠SOX7 與S100A8 基因啟動(dòng)子的結(jié)合部位，通過JASPAR 軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)大鼠S100A8 基因啟動(dòng)子區(qū)可能存在5 個(gè)SOX7 結(jié)合元件，并據(jù)此構(gòu)建了4個(gè)大鼠S100A8基因啟動(dòng)子截短熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，即pGL3?S100A8?1～4。之后將pGL3?S100A8?FL 或pGL3?S100A8?1～4 分別與pIRES2?SOX7 和pRL?SV40 共轉(zhuǎn)染HEK?293T 細(xì)胞，于48 h裂解細(xì)胞檢測各組RLU值，結(jié)果表明，pGL3?S100A8?4 熒光素酶活性顯著低于pGL3?S100A8?FL和pGL3?S100A8?1～3，提示SOX7 與S100A8基因啟動(dòng)子的結(jié)合元件可能位于啟動(dòng)子-200～+51 nt 之間。而根據(jù)JASPAR軟件預(yù)測結(jié)果，-200～+51 nt 區(qū)域含有1 個(gè)SOX7 結(jié)合元件（-86～-57 nt，5′?GAAATGCT?CAATGTGCTCAGTGATTGCCA C?3′），隨后，將該結(jié)合元件進(jìn)行序列突變，構(gòu)建S100A8啟動(dòng)子全長突變質(zhì)粒即pGL3?S100A8?M，并將pGL3?S100A8?FL 和pGL3?S100A8?M 分別與pIRES2?SOX7 和pRL?SV40共轉(zhuǎn)染HEK?293T 細(xì)胞，于48 h 裂解細(xì)胞檢測各組熒光素酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與pGL3?S100A8?FL相比，pGL3?S100A8?M 組熒光素酶活性顯著降低，提示S100A8基因啟動(dòng)子-86～-57 nt區(qū)可能是SOX7結(jié)合元件。不過有關(guān)SOX7 能否與該啟動(dòng)子區(qū)直接結(jié)合，仍需要通過染色質(zhì)免疫沉淀（chromatin immuno?precipitation，ChIP）實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確證。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了大鼠S100A8基因啟動(dòng)子全長熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，并在HEK?293T 細(xì)胞中證實(shí)過表達(dá)SOX7 可增強(qiáng)S100A8 基因的啟動(dòng)子活性。此外，用生物信息學(xué)軟件預(yù)測SOX7 結(jié)合元件的分布，據(jù)此設(shè)計(jì)并構(gòu)建了4個(gè)S100A8基因啟動(dòng)子截短熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，在HEK?293T 細(xì)胞中過表達(dá)SOX7 探討其對(duì)S100A8 基因啟動(dòng)子不同截短活性的影響，初步篩選出大鼠S100A8基因啟動(dòng)子區(qū)可能的SOX7 結(jié)合元件（-86～-57 nt）。接著對(duì)上述結(jié)合元件序列進(jìn)行突變，并在HEK?293T 細(xì)胞中檢查過表達(dá)SOX7 對(duì)S100A8 基因啟動(dòng)子突變質(zhì)粒啟動(dòng)的影響，進(jìn)一步確證了上述SOX7 結(jié)合元件的有效性。本研究結(jié)果為今后進(jìn)一步探究sublytic C5b?9刺激大鼠GMC后通過上調(diào)SOX7促進(jìn)S100A8基因的轉(zhuǎn)錄及其機(jī)制提供了必要的啟動(dòng)子質(zhì)粒和有用的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。