吳赟，曹錕

（廣東醫(yī)科大學(xué) 廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 東莞 523808）

芋螺是一類海洋無(wú)脊椎動(dòng)物，目前大約發(fā)現(xiàn)有700多種[1-2]。芋螺的毒管組織可以產(chǎn)生毒液，以捕獲獵物或防御天敵[3-4]。芋螺毒液的主要有效成分是一些通常包括12～50個(gè)氨基酸殘基和1～5對(duì)二硫鍵的多肽，這些多肽被稱為芋螺毒素[5,6]。芋螺毒素是功能多樣的分子，可以選擇性地靶向不同亞型的神經(jīng)遞質(zhì)或離子通道受體，通常被用于神經(jīng)科學(xué)研究的分子工具或臨床治療藥物[7-8]。芋螺毒素Lt14a（MCPLCKPSCTNC）含有13個(gè)氨基酸殘基，最早發(fā)現(xiàn)于信號(hào)芋螺的毒管cDNA文庫(kù)[9]。在此前的研究中發(fā)現(xiàn)，Lt14a可抑制疼痛，并且對(duì)人類細(xì)胞的毒性很低[10]；Lt14a以神經(jīng)元煙堿乙酰膽堿受體（nAChRs）為靶點(diǎn)，在被測(cè)濃度下不會(huì)誘導(dǎo)藥物依賴[11]。作為一種潛在的鎮(zhèn)痛化合物，目前Lt14a已經(jīng)進(jìn)入了臨床前研究階段。為了能夠進(jìn)一步的評(píng)價(jià)Lt14a的藥物性能，本研究合成了連續(xù)3個(gè)批次的Lt14a，并對(duì)樣品的穩(wěn)定性進(jìn)行了檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 多肽合成

采用Fmoc法連續(xù)合成3批芋螺毒素Lt14a 多肽原料藥（樣品批號(hào)：20190301、20190302、20190303）[12-13]。通過(guò)全自動(dòng)多肽合成儀（JB2014001，海南建邦）進(jìn)行多肽的合成。從儀器上裂解下來(lái)的多肽，用乙醚沉淀后，在1 500×g下離心10 min。收集沉淀，進(jìn)行冷凍干燥。取少量?jī)龈珊蟮拇蛛娜芙?，?jīng)10 000×g離心2 min去除雜質(zhì)后，上C18反相柱進(jìn)行高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography, HPLC，Agilent 1200，美國(guó)安捷倫）檢測(cè)及純化。線性梯度洗脫，215 nm和280 nm處雙波長(zhǎng)檢測(cè)。將HPLC收集的目標(biāo)峰取1 μL，進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)分析。確定多肽分子量正確后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果，收集HPLC純化后的目的峰，再次凍干。再經(jīng)HPLC純化，經(jīng)檢測(cè)達(dá)到95%以上純度后，第3次凍干成粉末，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 破壞性試驗(yàn)

1.2.1 酸破壞性試驗(yàn)

取3個(gè)批次的Lt14a樣品各5 mg，各加入0.1 mol·L-1HCl 10 mL，振搖后室溫放置12 h，過(guò)濾，吸取20 μL進(jìn)樣。根據(jù)HPLC譜圖，分別計(jì)算樣品和雜質(zhì)的峰面積。

1.2.2 堿破壞性試驗(yàn)

取3個(gè)批次的Lt14a樣品各5 mg，各加入0.1 mol·L-1NaOH 2 mL，振搖后室溫放置30 min，過(guò)濾，吸取20 μL進(jìn)樣。根據(jù)HPLC譜圖，分別計(jì)算樣品和雜質(zhì)的峰面積。

1.2.3 氧化破壞性試驗(yàn)

取3個(gè)批次的Lt14a樣品5 mg，各加入10% H2O21 mL，振搖后室溫放置30 min，過(guò)濾，吸取20 μL進(jìn)樣。根據(jù)HPLC譜圖，分別計(jì)算樣品和雜質(zhì)的峰面積。

1.2.4 光照破壞性試驗(yàn)

取3個(gè)批次的Lt14a樣品各5 mg，在4 500±500 Lx的光照條件下，在光照培養(yǎng)箱（PGX-280A-12H，寧波萊福）中放置7 d后，加入去離子水10 mL使其溶解并過(guò)濾，吸取20 μL進(jìn)樣。根據(jù)HPLC譜圖，分別計(jì)算樣品和雜質(zhì)的峰面積。

1.3 高溫高濕穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.3.1 高溫穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取20190301批次芋螺毒素Lt14a樣品15份，每份10 mg，置于潔凈并精密稱重的西林瓶中攤平，將西林瓶開(kāi)口置于濕度60%，溫度分別為40 ℃和60 ℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱（HSP-250B，上海坤天）中，分別于第0、5、10天各取樣3份，觀察外觀，并通過(guò)HPLC分析樣品含量。

1.3.2 高濕穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取20190301批次芋螺毒素Lt14a樣品15份，每份10 mg，置于潔凈并精密稱重的西林瓶中攤平，將西林瓶開(kāi)口置于為溫度25 ℃，濕度分別為75%和90%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，分別于第0、5、10天各取樣3份，觀察外觀，并通過(guò)HPLC分析樣品含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 芋螺毒素Lt14a多肽原料藥的合成

采用多肽合成儀合成了3個(gè)批次（批號(hào)：20190301、20190302、20190303）的芋螺毒素Lt14a，使用HPLC對(duì)其進(jìn)行了純化，最終Lt14a的樣品純度大于95%；通過(guò)質(zhì)譜鑒定了Lt14a的分子量與預(yù)測(cè)值相符，可以用于后續(xù)試驗(yàn)（圖1）。

圖1 芋螺毒素Lt14a（20190301批次）的HPLC純化圖（A）和質(zhì)譜鑒定圖（B）

2.2 破壞性試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)3個(gè)批次的芋螺毒素Lt14a樣品分別進(jìn)行酸、堿、氧化、光照破壞后，通過(guò)HPLC檢測(cè)破壞性試驗(yàn)結(jié)果。將HPLC譜圖中的Lt14a樣品峰和雜質(zhì)峰分別統(tǒng)計(jì)峰面積和百分率（表1）。從結(jié)果統(tǒng)計(jì)表中可以看出，經(jīng)過(guò)12 h的酸破壞，共產(chǎn)生了4個(gè)雜峰，而Lt14a樣品峰面積依然大于88%。但是經(jīng)過(guò)30 min的堿和氧化破壞后，Lt14a樣品峰面積只有85%左右。長(zhǎng)時(shí)間的光照對(duì)于Lt14a的影響則不是很大，樣品峰面積都大于95%。

表1 芋螺毒素Lt14a的破壞性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 高溫穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

將芋螺毒素Lt14a樣品在正常濕度下，分別放置于40 ℃和60 ℃的環(huán)境中5 d和10 d之后，觀測(cè)其外觀形狀依然保持為白色結(jié)晶性粉末，無(wú)明顯變化。稱重后發(fā)現(xiàn)，重量略有下降。HPLC檢測(cè)含量后發(fā)現(xiàn)，樣品含量有所下降，但是依然大于95%。

表2 芋螺毒素Lt14a的高溫穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 高濕穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

將芋螺毒素Lt14a樣品在正常溫度下，分別放置于濕度為75%和90%的環(huán)境中5 d和10 d之后，觀測(cè)其外觀形狀依然保持為白色結(jié)晶性粉末，無(wú)明顯變化。稱重后發(fā)現(xiàn)，重量略有升高。HPLC檢測(cè)含量后發(fā)現(xiàn)，樣品含量基本無(wú)變化，均大于98%。

表3 芋螺毒素Lt14a的高濕穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié) 論

經(jīng)過(guò)以上穩(wěn)定性試驗(yàn)研究，化學(xué)合成的芋螺毒素Lt14a樣品在酸性和光照環(huán)境下穩(wěn)定性較好；同時(shí)應(yīng)該避免暴露于堿性和氧化環(huán)境下；高溫或高濕的環(huán)境對(duì)Lt14a樣品基本無(wú)影響。因此，通過(guò)化學(xué)合成獲得的Lt14a樣品的穩(wěn)定性能夠滿足臨床前研究的樣品需要。