王悄悄，李超龍，張會芳，劉旭苗，鄭 峰，汪春暉，潘秀珍，曹祥榮

豬鏈球菌(Streptococcussuis,S.suis)是一種重要的人獸共患病病原菌，不僅可以通過上呼吸道感染豬，也可以通過皮膚傷口或經(jīng)口途徑感染人[1]。人感染該菌的臨床癥狀表現(xiàn)為腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎等，病死率高達12.8%，常見后遺癥包括聽力損失和前庭功能障礙[2]。S.suis血清型眾多，目前較為公認的有29種[3-4]，全世界已經(jīng)報道了1 600余例人類感染病例，其中75%的病例是由2型豬鏈球菌(S.suis2)引起的[5]。S.suis2對公共健康造成了嚴重威脅，因此，對于S.suis2致病機制的研究具有重要意義。

CovR最早發(fā)現(xiàn)于化膿鏈球菌，通常與CovS(CsrS)共同組成二元信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)(two-component signal transduction system，TCS)，主要參與透明質(zhì)酸莢膜合成基因hasAB的調(diào)控[5]。課題組前期對CovR的研究發(fā)現(xiàn)，CovR是全面調(diào)節(jié)基因表達的負調(diào)控因子，其調(diào)控的下游靶基因可能涉及多個已知毒力因子及潛在的毒力因子[6]，然而，在S.suis2 05ZYH33基因組中未發(fā)現(xiàn)covS的同源基因，表明CovR是一個孤兒調(diào)控因子。近期，有研究發(fā)現(xiàn)絲/蘇氨酸激酶可以對多種TCS發(fā)揮磷酸化調(diào)控，在無乳鏈球菌中STK1可以在體外對CovR/S的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)因子組分CovR進行磷酸化[7]。在S.suis2中也存在絲/蘇氨酸激酶STK，研究表明STK通過磷酸化底物蛋白的絲氨酸/蘇氨酸殘基以達到調(diào)控靶蛋白的目的，從而在轉(zhuǎn)錄與翻譯、細胞壁合成、細胞分裂、應(yīng)激反應(yīng)以及毒力因子的表達[8-11]等過程中發(fā)揮著重要作用。然而S.suis2編碼的STK是否能對全局性毒力負調(diào)控因子CovR進行磷酸化作用尚不清楚。本研究參照Molle等[12]的實驗方法，在E.coliBL21原核表達系統(tǒng)中共表達STK與CovR蛋白，旨在探討STK對CovR的磷酸化作用以及尋找CovR關(guān)鍵磷酸化位點，為進一步探索CovR磷酸化機制及S.suis2的致病作用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1菌株、質(zhì)粒及引物S.suis2中國強毒株05ZYH33分離自2005年四川資陽中毒性休克癥病人，實驗室保存；E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)菌株購自北京全式金公司；pMD-19T購自日本TaKaRa公司；pCDFDuet-1購自美國Novagen公司；引物由上海賽百盛公司合成，堿基序列見表1。

表1 實驗所用引物

1.2主要試劑與儀器 限制性內(nèi)切酶BamH I、Hind III、XhoI、SalI、T4 DNA連接酶購自日本TaKaRa公司；DNA膠回收試劑盒購自美國Promega公司；Ni-NTA親和層析柱購自南京金斯瑞公司；抗CovR蛋白單克隆抗體實驗室保存[13]；抗蘇/絲/酪氨酸磷酸化抗體、羊抗兔(鼠)IgG(HRP標記)購自北京Bioss公司；ECL化學發(fā)光試劑盒購自美國Thermo Scientific公司。

1.3重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 以S.suis2 05ZYH33基因組DNA為模板，分別以covR-F/covR-R、stk-F/stk-R為引物，PCR擴增目的基因covR和stk，隨后使用DNA膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行回收。回收的covR片段和pCDFDuet-1質(zhì)粒經(jīng)BamH I、Hind III雙酶切、T4 DNA連接酶連接并轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α后，獲得pCDFDuet-1::covR重組質(zhì)粒(其表達產(chǎn)物命名為CovR1)。將上述pCDFDuet-1::covR重組質(zhì)粒和stk片段經(jīng)NdeI、XhoI雙酶切連接轉(zhuǎn)化后獲得pCDFDuet-1::covR/stk重組質(zhì)粒(其表達產(chǎn)物命名為CovR2)。pCDFDuet-1::covR、pCDFDuet-1::covR/stk質(zhì)粒經(jīng)酶切驗證正確后送蘇州金唯智公司測序。共表達質(zhì)粒pCDFDuet-1::covR/stk構(gòu)建示意圖見圖1。

圖1 共表達質(zhì)粒pCDFDuet-1::covR/stk構(gòu)建示意圖

1.4重組蛋白的表達純化 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pCDFDuet-1::covR和pCDFDuet-1::covR/stk分別轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞，得到BL21-pCDFDuet-1::covR及BL21-pCDFDuet-1::covR/stk重組蛋白表達菌株。將上述重組表達菌轉(zhuǎn)接于新鮮LB液體培養(yǎng)基(Spc抗性)中振蕩培養(yǎng)至OD600≈0.6，添加IPTG(終濃度為1 mmol/L)進行誘導。誘導結(jié)束后，進行超聲破碎(300 W，超5 s，停5 s)，離心收集蛋白上清液，并使用Ni-NTA親和層析柱進行蛋白純化，對純化后的CovR1、CovR2重組蛋白進行12% SDS-PAGE電泳鑒定。

1.5重組蛋白的Western blot鑒定及磷酸化檢測 將CovR1、CovR2蛋白進行12% SDS-PAGE電泳，使用電轉(zhuǎn)印(濕轉(zhuǎn)恒流300 mA，60 min)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以本實驗室保存的抗CovR蛋白單克隆抗體為一抗，羊抗鼠IgG(HRP標記)為二抗，對上述CovR1、CovR2蛋白進行特異性檢測。另外，以抗蘇氨酸磷酸化抗體為一抗，以羊抗兔IgG(HRP標記)為二抗，對CovR1、CovR2蛋白進行磷酸化檢測。

1.6CovR蛋白磷酸化位點質(zhì)譜檢測 將純化后的CovR2蛋白進行12% SDS-PAGE電泳，用考馬斯亮藍R-250染色液染色10 min，脫色液脫色2 h，割取目的條帶送北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司進行磷酸化質(zhì)譜鑒定。

1.7定點突變質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)質(zhì)譜檢測結(jié)果，利用全基因合成技術(shù)合成covR基因點突變序列使CovR蛋白的潛在磷酸化位點突變?yōu)楸彼?。covR基因點突變序列有以下4種：covRT(CovR中Thr磷酸化位點突變?yōu)锳la)、covRS(CovR中Ser磷酸化位點突變?yōu)锳la)、covRY(CovR中Tyr磷酸化位點突變?yōu)锳la)、covRA(CovR中所有磷酸化位點突變?yōu)锳la)。將4種covR基因點突變序列與pCDFDuet-1::stk質(zhì)粒連接后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α中，涂布到含Spc抗性(100 μg/mL)的LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，PCR驗證陽性克隆后，提取質(zhì)粒送至蘇州金唯智公司測序，將測序正確的質(zhì)粒分別命名為pCDFDuet-1::stk/covRT、pCDFDuet-1::stk/covRS、pCDFDuet-1::stk/covRY、pCDFDuet-1::stk/covRA。

1.8定點突變蛋白的誘導表達及純化 將上述4種突變重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達菌株E.coliBL21(DE3)中，并分別接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，按上述1.4步驟中蛋白純化方案進行定點突變蛋白的誘導表達及純化。純化后的重組突變蛋白分別命名為CovRT、CovRS、CovRY及CovRA。

1.9定點突變蛋白的Western blot鑒定及磷酸化檢測 參照步驟1.5，使用抗CovR蛋白單克隆抗體對CovRT、CovRS、CovRY及CovRA 4種突變蛋白進行Western blot鑒定，檢測純化后突變蛋白的特異性。另外，分別用抗蘇/絲/酪氨酸磷酸化抗體對4種突變蛋白進行磷酸化檢測，以鑒定突變蛋白的磷酸化特性。

2 結(jié) 果

2.1CovR重組表達質(zhì)粒的酶切驗證 對pCDFDuet-1::covR重組質(zhì)粒進行BamH I/Hind III雙酶切及BamH I單酶切驗證，單酶切條帶大小在4 500 bp左右，雙酶切條帶大小在500～750 bp、3 000～4 500 bp之間，與預(yù)期大小4 468 bp、687 bp、3 781 bp相符(圖2A)。對pCDFDuet-1::covR/stk進行NdeI單酶切鑒定，單酶切條帶大小在4 500 bp之上，與預(yù)期大小6 460 bp相符(圖2B)。結(jié)果表明上述兩個重組表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。

A: M.DNA maker; 1.Plasmid pCDFDuet-1::covR; 2.BamH I digestion; 3.BamH I/Hind III digestion;B: M.DNA maker; 1.Plasmid pCDFDuet-1::covR/stk; 2.Nde I digestion

2.2CovR1、CovR2蛋白純化 對純化后的CovR1、CovR2重組蛋白進行12% SDS-PAGE電泳，蛋白條帶在25 kDa附近，與預(yù)期大小26 kDa相符，且蛋白條帶單一，說明純化后的重組蛋白純度較高(圖3A)。

2.3CovR1、CovR2蛋白Western blot鑒定與磷酸化檢測 使用抗CovR蛋白單克隆抗體和特異抗蘇氨酸磷酸化抗體分別對CovR1、CovR2重組蛋白進行Western blot鑒定。在25 kDa附近有明顯的蛋白印記條帶，與目的蛋白大小(26 kDa)相符，說明CovR1、CovR2重組蛋白均可以與抗CovR蛋白單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，表明CovR1、CovR2蛋白純化成功(圖3 B)。CovR1蛋白與抗蘇氨酸磷酸化抗體孵育后沒有目的條帶，而CovR2蛋白在相應(yīng)位置處有目的條帶，說明單獨表達的CovR1蛋白未發(fā)生蘇氨酸磷酸化，而與STK蛋白共同表達的CovR2蛋白可以被磷酸化(圖3C)。結(jié)果表明CovR與STK在E.coliBL21(DE3)中共表達后，CovR發(fā)生了磷酸化修飾。

A: M.Protein marker; 1.CovR1; 2.CovR2；B: Anti-CovR monoclonal antibody; 1.CovR1; 2.CovR2；C: Anti-phosphothreonine antibody; 1.CovR1; 2.CovR2

2.4CovR2蛋白磷酸化位點的質(zhì)譜檢測 將純化的CovR2進行蛋白磷酸化質(zhì)譜檢測，發(fā)現(xiàn)CovR2蛋白的第45、148、150、159、168、194、219位蘇氨酸，第40、172、215位絲氨酸以及第225位酪氨酸發(fā)生了磷酸化修飾。

2.5CovR定點突變蛋白表達與純化 構(gòu)建pCDFDuet-1::stk/covRT、pCDFDuet-1::stk/covRS、pCDFDuet-1::stk/covRY、pCDFDuet-1::stk/covRA重組質(zhì)粒，經(jīng)IPTG對誘導表達后純化CovRT(第45、148、150、159、168、194、219位Thr替換為Ala)、CovRS(第40、172、215位Ser替換為Ala)、CovRY(第225位Tyr替換為Ala)、CovRA(所有磷酸化位點替換為Ala)，對其進行12% SDS-PAGE鑒定，4種突變蛋白電泳條帶單一，說明純化的突變蛋白純度較高，條帶均在25 kDa上方，與預(yù)期大小26 kDa相符(圖4A)。使用抗CovR單克隆抗體對4種突變蛋白進行Western blot鑒定，均出現(xiàn)單一條帶，且條帶大小與預(yù)期相符(圖4B)。結(jié)果表明CovRT、CovRS、CovRY、CovRA定點突變蛋白純化成功。

A: M.Protein marker; 1.CovRT; 2.CovRS; 3.CovRY; 4.CovRA；B: Anti-CovR monoclonal antibody; 1.CovRT; 2.CovRS; 3.CovRY; 4.CovRA

2.6CovR關(guān)鍵磷酸化位點鑒定 使用特異抗蘇氨酸磷酸化抗體對純化的CovRT、CovRS、CovRY、CovRA定點突變蛋白進行蘇氨酸磷酸化檢測，結(jié)果顯示只有CovRS和CovRY可以被磷酸化，而CovRT和CovRA未檢測到磷酸化信號，說明45、148、150、159、168、194、219位蘇氨酸為CovR磷酸化位點。使用特異抗絲氨酸磷酸化抗體對4種突變蛋白檢測，結(jié)果顯示只有CovRT和CovRY可以被磷酸化，而CovRS和CovRA未檢測到磷酸化信號，說明40、172、215位絲氨酸為CovR磷酸化位點。使用特異抗酪氨酸磷酸化抗體對4種突變蛋白檢測，結(jié)果顯示只有CovRT、CovRS可以被磷酸化，而CovRY、CovRA未檢測到磷酸化信號，說明225酪氨酸是CovR磷酸化位點。以上結(jié)果表明CovR的絲/蘇/酪氨酸均可發(fā)生磷酸化修飾(圖5)。

A: Anti-phosphothreonine antibody; B: Anti-phosphoserine antibody; C: Anti-phosphotyrosine antibody；M: Protein marker; 1: CovR1; 2: CovR2; 3: CovRT; 4: CovRS; 5: CovRY; 6: CovRA

3 討 論

實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)S.suis2 05ZYH33株基因組中存在反應(yīng)調(diào)節(jié)因子CovR。構(gòu)建covR敲除突變株，發(fā)現(xiàn)突變株的毒力和致病性明顯增強；比較野毒株和突變株的轉(zhuǎn)錄譜，發(fā)現(xiàn)突變株中有195個基因(占全基因組的8.9%)的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了變化，其中193個基因呈上調(diào)表達，而2個基因呈下調(diào)表達。研究結(jié)果表明，在豬鏈球菌中CovR是全面調(diào)節(jié)基因表達的負調(diào)控因子[6]。除此之外，還通過基因克隆、雜交瘤技術(shù)制備了CovR重組蛋白和CovR單克隆抗體[13]；采用多種技術(shù)篩選到兩個CovR直接調(diào)控的靶基因[14]，并對多個受CovR調(diào)控的靶基因的生物學功能進行了研究[15-18]。

CovR通常與CovS(CsrS)共同組成二元信號系統(tǒng)，CovS/CovR最初是作為透明質(zhì)酸莢膜合成基因hasAB的負調(diào)控子而被發(fā)現(xiàn)的[5]，隨后發(fā)現(xiàn)它不僅對透明質(zhì)酸莢膜的產(chǎn)生起著負調(diào)控作用，還對外毒素、溶血素、鏈激酶、鏈道酶等其它毒力因子的轉(zhuǎn)錄表達起負調(diào)控作用[19]。課題組前期對S.suis2 05ZYH33株基因組進行分析，并未發(fā)現(xiàn)編碼CovS的同源基因，表明CovR在S.suis2中是一個孤兒調(diào)控因子。近期研究表明，在化膿鏈球菌中CovR作為負反應(yīng)調(diào)節(jié)因子參與毒力因子的調(diào)控，通過質(zhì)譜以及定點突變證實絲氨酸/蘇氨酸激酶STK可以使CovR蛋白的第65位蘇氨酸磷酸化[20]。在無乳鏈球菌中，STK1使CovR蛋白的第65位蘇氨酸磷酸化，磷酸化后的CovR不能與其靶基因的啟動子結(jié)合[21]。以上研究證實了在細菌中絲/蘇氨酸激酶系統(tǒng)與TCS系統(tǒng)之間存在交互作用，提示我們在S.suis2中絲/蘇氨酸激酶STK也有可能使CovR磷酸化，從而調(diào)節(jié)CovR蛋白的活性。

本研究將CovR與STK蛋白在E.coliBL21原核表達系統(tǒng)中共表達，通過對CovR2蛋白進行磷酸化質(zhì)譜檢測，發(fā)現(xiàn)第45、148、150、159、168、194、219位蘇氨酸，第40、172、215位絲氨酸以及第225位酪氨酸為CovR蛋白的磷酸化位點。利用全基因合成技術(shù)合成covR基因點突變序列，使CovR蛋白的潛在磷酸化位點突變?yōu)楸彼幔Χc突變蛋白進行蘇氨酸、絲氨酸以及酪氨酸磷酸化檢測。蘇氨酸磷酸化檢測結(jié)果顯示CovRS、CovRY磷酸化信號仍然存在，CovRT、CovRA的磷酸化信號消失；絲氨酸磷酸化檢測結(jié)果顯示CovRT、CovRY磷酸化信號仍然存在，CovRS、CovRA的磷酸化信號消失；酪氨酸磷酸化檢測結(jié)果顯示，CovRS、CovRT磷酸化信號仍然存在，CovRY、CovRA的磷酸化信號消失。CovR定點突變蛋白的磷酸化檢測結(jié)果證實了CovR蛋白的絲/蘇/酪氨酸殘基均可發(fā)生磷酸化。除此之外，由于結(jié)果顯示CovR2蛋白酪氨酸殘基也發(fā)生了磷酸化，提示STK蛋白可能具有酪氨酸激酶的特性，但CovR是否作為STK直接磷酸化修飾作用底物，仍需要進一步深入研究。

本研究利用共表達載體在E.coliBL21原核表達系統(tǒng)中初步探究了絲/蘇氨酸激酶STK與CovR的磷酸化關(guān)系，通過蛋白磷酸化質(zhì)譜技術(shù)以及對定點突變蛋白磷酸化檢測確定了孤兒調(diào)控因子CovR的關(guān)鍵磷酸化位點，為在2型豬鏈球菌中進一步探索CovR的磷酸化機制奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突：無