黃明耀，梁文立，吳婉婷，劉 足，謝淑媚，鄧穎穎，傅俊方，姜長(zhǎng)宏，龍 軍，江凌曉

布魯氏菌病(Brucellosis)簡(jiǎn)稱“布病”，是一種具有傳染性的人獸共患病，由布魯氏菌引起。臨床鑒定布魯氏菌的方法主要有需氧血培養(yǎng)和血清學(xué)檢測(cè)，其中培養(yǎng)是金標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)臨床發(fā)現(xiàn)不明原因發(fā)熱的患者時(shí)，通常抽取10 mL靜脈血到血培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)，血培養(yǎng)報(bào)陽(yáng)后轉(zhuǎn)至血平板繼續(xù)培養(yǎng)16～24 h，通過(guò)質(zhì)譜儀或微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，至少需要18～48 h，而且在平板培養(yǎng)觀察以及調(diào)制菌懸液的過(guò)程中易產(chǎn)生氣溶膠，存在實(shí)驗(yàn)室感染風(fēng)險(xiǎn)。本研究擬建立一種基于CRISPR/Cas13a的布魯氏菌鑒定方法，該方法可以對(duì)需氧血培養(yǎng)陽(yáng)性培養(yǎng)物中存在的布魯氏菌進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1實(shí)驗(yàn)菌株 布魯氏菌64株(由廣東省CDC提取DNA后提供，菌株均分離自臨床患者全血培養(yǎng)物)，包括羊種布魯氏菌27株、豬種布魯氏菌7株、牛種布魯氏菌1株和未知亞種布魯氏菌29株。

非布魯氏菌56株：包括革蘭陰性桿菌28株(沙門氏菌2株、大腸埃希菌5株、陰溝腸桿菌1株、產(chǎn)氣腸桿菌1株、肺炎克雷伯氏菌3株、產(chǎn)酸克雷伯菌1株、鮑曼不動(dòng)桿菌5株、銅綠假單胞菌3株、粘質(zhì)沙雷氏菌2株、瓊氏不動(dòng)桿菌1株、嗜麥芽窄食單胞菌1株、嗜水/豚鼠氣單胞菌1株、腦膜敗血伊麗莎白金菌1株、皮氏羅爾斯頓菌1株)、革蘭陽(yáng)性球菌24株(無(wú)乳鏈球菌2株、化膿鏈球菌1株、星座鏈球菌1株、咽峽鏈球菌1株、表皮葡萄球菌2株、金黃色葡萄球菌3株、緩慢葡萄球菌1株、溶血葡萄球菌2株、頭部葡萄球菌2株、人葡萄球菌2株、糞腸球菌4株、屎腸球菌1株、苛養(yǎng)顆粒鏈菌1株、膠粘羅斯菌1株)、革蘭陽(yáng)性桿菌1株(非發(fā)酵棒狀桿菌1株)、真菌1株(紅曲霉1株)以及和布魯氏菌親緣關(guān)系相近的人蒼白桿菌1株和流感嗜血桿菌1株[1-2]。以上菌株均經(jīng)過(guò)VITEK 2或VITEK MS鑒定，并由本室保存。

1.1.2人類DNA 人類DNA購(gòu)自索萊寶科技有限公司(中國(guó)北京)。

1.1.3臨床樣本 臨床收集的57例成人需氧陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶，包括55例靜脈血培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶和2例關(guān)節(jié)積液培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶，來(lái)自41個(gè)患者。其中36例報(bào)陽(yáng)時(shí)間≥2.0 d，21例報(bào)陽(yáng)時(shí)間為1.5～2.0 d。

1.1.4引物、crRNA和ssRNA 正向引物BCSP31-F6(5′→3′)：5′-TAATACGACTCACTATAGGGGGGCGCTCTGGAGTCCGGCTTTACGC-AGTC-3′。反向引物BCSP31-R6(3′→5′)：3′-GACCGATTTGATGTTTGCATCCTTACGCGC-AACGA-5′。crRNA：5′-GGGGAUUUAGACUA-CCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGGU-AAAGCGUCGCCAGAAGGCGCAAAUC-3′。ssRNA探針：5′-6-FAM-UUUUUC-BHQ1。

1.1.5Cas13a蛋白 Cas13a的開(kāi)放閱讀框(open reading frame, ORF)是優(yōu)化密碼子后合成的，然后將Cas13a ORF克隆到表達(dá)載體Pc013中，并轉(zhuǎn)染到大腸桿菌BL21中。大腸桿菌BL21首先在37 ℃下生長(zhǎng)，然后與IPTG在16 ℃下孵育。再使用Ni-NTA方法從裂解細(xì)菌中純化蛋白，將純化蛋白樣本等分保存在-80 ℃下[3]。其他試劑如重組酶聚合酶、NTP、Buffer A和Buffer B等購(gòu)自生工生物工程股份有限公司(中國(guó)上海)。

1.1.6儀器 Real-Time PCR儀Gentier 48E購(gòu)自天隆科技有限公司(中國(guó)西安)。

1.2方 法

1.2.1陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶處理 用注射器抽取符合時(shí)間要求的需氧陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶菌液1.2 mL，其中0.1 mL(約2滴)接種至血平板，常規(guī)培養(yǎng)16～24 h，進(jìn)行VITEK 2或VITEK MS鑒定；剩余菌液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，100 ℃ 30 min滅活，以3 000 r/min離心3 min后取500 μL上清菌液，存-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 核酸提取

1.2.2.1實(shí)驗(yàn)菌株核酸提取 將凍存的56株非布魯氏菌菌株復(fù)蘇，分別接種至血平板，培養(yǎng)16～24 h后取單個(gè)菌落，用1 mL生理鹽水洗脫至1.5 mL EP管中。隨后再將菌液以13 000 r/min離心10 min，棄上清余下50 μL沉淀。震蕩混勻后100 ℃ 10 min，再次13 000 r/min離心10 min，取2.5 μL的上清液作為CRISPR/Cas13a-Brucella模板。

1.2.2.2陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶?jī)龃婢汉怂崽崛?-20 ℃凍存上清菌液500 μL，13 000 r/min離心10 min，棄上清余下50 μL沉淀。震蕩混勻后100 ℃ 10 min，再次13 000 r/min離心10 min，取2.5 μL上清液作為CRISPR/Cas13a-Brucella模板。

1.2.3CRISPR/Cas13a-Brucella分析 CRISPR/Cas13a-Brucella分析包括重組酶聚合酶擴(kuò)增(Reverse-transcription Recombinase Polymerase Amplification, RPA)、T7轉(zhuǎn)錄以及Cas13a檢測(cè)[3]。

擴(kuò)增體系(25 μL)：每個(gè)反應(yīng)包含2.5 μL模板、正反引物各0.5 μL(濃度均為10 μmol/L)、20.75 μL的Buffer A、1.25 μL的Buffer B(濃度為14 mmol/L醋酸鎂)和RPA酶混合物。每個(gè)反應(yīng)共有25 μL混合物。

反應(yīng)體系(4 μL)：每個(gè)反應(yīng)包含crRNA 1 μL(濃度為33.3 nmol/L)、Cas13a蛋白1 μL(濃度為66.7 nmol/L)、0.25 μL的T7 RNA聚合酶(安諾論生物科技有限公司，北京)、1.25 μL的NTP(濃度為10 mmol/L)和ssRNA探針0.5 μL(濃度為166 nmol/L)。每個(gè)反應(yīng)共有4 μL CRISPR/Cas13a反應(yīng)混合物。

檢測(cè)：首先將配好的擴(kuò)增體系置于37 ℃恒溫金屬浴中孵育30 min，然后添加4 μL CRISPR/Cas13a反應(yīng)混合物。即刻用PCR儀進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)，每分鐘檢測(cè)1次熒光信號(hào)，持續(xù)收集30 min熒光信號(hào)。每批實(shí)驗(yàn)以無(wú)核酸酶水為陰性質(zhì)控NC，以0.46 ng/μL 的布魯氏菌提純DNA為陽(yáng)性質(zhì)控。

結(jié)果判讀：首先根據(jù)待測(cè)樣本的終點(diǎn)熒光值和初始熒光值計(jì)算待測(cè)樣本的擴(kuò)增趨勢(shì)值(Amplification trend value，AT)，AT=待測(cè)樣本終點(diǎn)熒光值/待測(cè)樣本初始熒光值；然后根據(jù)待測(cè)樣本終點(diǎn)熒光值與陰性質(zhì)控NC的終點(diǎn)熒光值計(jì)算待測(cè)樣本的熒光倍數(shù)變化值(Fluorescence multiple change value，F(xiàn)C)，F(xiàn)C=待測(cè)樣本終點(diǎn)熒光值/NC終點(diǎn)熒光值。當(dāng)FC≥2且AT≥2時(shí)，判斷為陽(yáng)性；當(dāng)FC≥2而11則判為陽(yáng)性；否則判斷為陰性。

1.2.4檢測(cè)下限(LOD)評(píng)估 布魯氏菌純DNA通過(guò)Qubit(Thermo Fisher，Massachusetts)測(cè)定濃度，使用以下公式計(jì)算基因組拷貝數(shù)：拷貝數(shù)=(6.02×1023)×(DNA濃度×10-9)/(DNA長(zhǎng)度×660)。用無(wú)核酸酶的水進(jìn)行10倍梯度稀釋至1 fg/μL，每個(gè)滴度取2.5 μL用作模板。進(jìn)行10次重復(fù)試驗(yàn)，評(píng)估CRISPR/Cas13a方法的檢測(cè)下限。

2 結(jié) 果

2.1檢測(cè)下限 梯度稀釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1)顯示本方法檢測(cè)下限為10 fg/μL(約1 copy/μL)。

圖1 不同濃度樣本擴(kuò)增曲線

2.2敏感性和特異性 根據(jù)鑒定結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)，64株布魯氏菌CRISPR/Cas13a方法鑒定為陽(yáng)性，且陽(yáng)性最小FC值為2.1；56株非布魯氏菌和人DNA為陰性，陰性最大FC值是1.9，設(shè)定2.0為截?cái)嘀狄酝耆珔^(qū)分陽(yáng)性組和陰性組(圖2)。計(jì)算敏感性和特異性均為100%。

圖2 從敏感性和特異性試驗(yàn)中獲得的FC

2.3臨床樣本檢測(cè) 57例臨床需氧血培養(yǎng)陽(yáng)性菌液以培養(yǎng)鑒定結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)結(jié)果為CRISPR/Cas13a方法的敏感性和特異性均為100%。

3 討 論

由于畜牧業(yè)的發(fā)展和檢疫制度的不健全，全球每年新增布魯氏菌病患超過(guò)50萬(wàn)例[4]，在我國(guó)，布魯氏菌病已成為近年來(lái)報(bào)告發(fā)病數(shù)上升速度最快的傳染病之一[5]。人類主要通過(guò)接觸被布魯氏菌污染的動(dòng)物制品而感染，被感染者可出現(xiàn)布魯氏菌病的典型癥狀，如持續(xù)發(fā)熱、出汗、疲勞和關(guān)節(jié)痛[6]。

臨床常見(jiàn)鑒定布魯氏菌的方法有需氧培養(yǎng)、血清學(xué)檢測(cè)、核酸擴(kuò)增試驗(yàn)[7]和二代測(cè)序分析，以細(xì)菌培養(yǎng)最常用，培養(yǎng)鑒定布魯氏菌是診斷布魯氏菌病的金標(biāo)準(zhǔn)，但是布魯氏菌是生長(zhǎng)緩慢的革蘭陰性、需氧和兼性胞內(nèi)桿菌[8]，需氧血培養(yǎng)瓶報(bào)陽(yáng)時(shí)間通常為2.5～3.5 d，有時(shí)甚至更長(zhǎng)，報(bào)陽(yáng)后轉(zhuǎn)血平板培養(yǎng)和鑒定至少還需要18～48 h，且存在極大的實(shí)驗(yàn)室感染風(fēng)險(xiǎn)，由氣溶膠導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)室污染時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重威脅工作人員的身心健康。血清學(xué)檢測(cè)也比較常用，但是該方法缺乏特異性，而且對(duì)于慢性感染、再感染、復(fù)發(fā)及反復(fù)暴露于布魯氏菌的人群其檢查結(jié)果解讀較為困難，難以區(qū)分活動(dòng)性感染與既往感染[5]。近年來(lái)分子診斷布魯氏菌被認(rèn)為是理想的診斷工具，核酸擴(kuò)增試驗(yàn)敏感性和特異性較好，并且可區(qū)分急性、慢性、再感染和復(fù)發(fā)[9]，但普通熒光PCR檢測(cè)方法擴(kuò)增程序較復(fù)雜，所以在臨床上難以推廣。二代測(cè)序分析可以同時(shí)檢測(cè)多種病原體，但敏感性低于普通熒光PCR，測(cè)序時(shí)間較長(zhǎng)且依賴昂貴的設(shè)備及生信分析技術(shù)，目前主要用于鑒定疑難、危重病例樣本的檢測(cè)，尚不能作為常規(guī)診斷方法[10]。臨床急需新的分子診斷方法，應(yīng)用于布魯氏菌的快速診斷。

自2017年張鋒團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道應(yīng)用以CRISPR/Cas13a為基礎(chǔ)的診斷方法檢測(cè)寨卡病毒和登革病毒以來(lái)[11]，該技術(shù)展示了良好的臨床應(yīng)用前景。該方法的原理是以病原體基因的靶標(biāo)區(qū)域設(shè)計(jì)特異的引物，對(duì)靶標(biāo)區(qū)域進(jìn)行RPA恒溫?cái)U(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)T7逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄得到靶標(biāo)RNA(target RNA)，target RNA與Cas13a-crRNA復(fù)合物的crRNA結(jié)合后激活Cas13a酶的側(cè)切活性，切割ssRNA熒光探針[12]，利用熒光檢測(cè)器檢測(cè)樣本熒光變化值。2019年張文宏團(tuán)隊(duì)也報(bào)道了應(yīng)用該技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分支桿菌，并且顯示與GeneXpert分析方法具有相當(dāng)?shù)拿舾行訹13]。為了滿足臨床需求，我們應(yīng)用這個(gè)技術(shù)建立了快速鑒定布魯氏菌的方法。

基于CRISPR/Cas13a的布魯氏菌鑒定方法，可以對(duì)需氧血培養(yǎng)陽(yáng)性培養(yǎng)物中存在的布魯氏菌進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定，大約2 h即可完成，為患者爭(zhēng)取早診斷、早治療的寶貴時(shí)間。該方法也較為簡(jiǎn)便，不依賴昂貴的設(shè)備和復(fù)雜的技術(shù)，用于檢測(cè)樣本初始熒光值和終點(diǎn)熒光值的熒光PCR儀可以使用Qubit核酸定量?jī)x替代。而且該方法鑒定布魯氏菌時(shí)樣本先經(jīng)過(guò)滅菌處理，操作過(guò)程中安全性高，極大地減少實(shí)驗(yàn)室氣溶膠感染的風(fēng)險(xiǎn)。此外，依據(jù)本實(shí)驗(yàn)中已知樣本的鑒定結(jié)果顯示，該方法鑒定布魯氏菌的敏感性和特異性可達(dá)100%，檢測(cè)下限接近10 fg/μL，且對(duì)布魯氏菌不同生物型如羊種布魯氏菌、豬種布魯氏菌和牛種布魯氏菌均可鑒定。本實(shí)驗(yàn)在對(duì)57份需氧血培養(yǎng)報(bào)陽(yáng)后的菌液樣本和120份純菌落樣本的鑒定中未出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果，但是由于受非疫區(qū)條件限制，檢測(cè)樣本數(shù)量有限，該方法的敏感性和特異性需要在臨床實(shí)踐中進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，并且由于無(wú)法獲取布魯氏菌污染的肉類或奶制品等樣本，檢測(cè)該類型樣本時(shí)的敏感性和特異性有待進(jìn)一步評(píng)估。此外，基于CRISPR/Cas13a的鑒定方法實(shí)驗(yàn)室成本估計(jì)為每個(gè)樣品35元，可以在工業(yè)化規(guī)模上更便宜。由于該方法復(fù)雜性很低，因此將整個(gè)測(cè)試整合到緊湊的臺(tái)式儀器中進(jìn)行自動(dòng)進(jìn)樣報(bào)告分析是非?？尚械?。

利益沖突：無(wú)