王 煒，陳 磊，陳明心，張 岱，蔣 露，任偉宏

結核分枝桿菌引起的感染性疾病是造成人類死亡的十大病因之一。2018年全球有1 000萬人感染結核分枝桿菌。由于抗生素在臨床中的長期、大量使用，耐藥結核菌感染病例逐年增多，使得結核分枝桿菌的感染防治工作面臨前所未有的嚴峻挑戰(zhàn)，因此，開發(fā)新型抗結核藥物迫在眉睫。然而，結核病的藥物開發(fā)已經停滯了數(shù)十年[1]。氨酰tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase，aaRS)是一個大而多樣的家族，對細胞生存起著重要作用。抑制這個酶家族成員的活性可導致蛋白質合成終止，達到抗菌和抗寄生蟲的目的[2]，抑制tRNA氨酰化是一種有效的抗菌策略[3]。aaRS抑制劑的研究近年來備受關注,采用不同的方法、策略，一系列aaRS抑制劑被合成出來[4]。針對不同種類的aaRS[5-9]，aaRS抑制劑表現(xiàn)出較好的選擇性[10]，對哺乳動物的低毒性[11-13]，與aaRS親和力高，能夠強烈抑制蛋白質合成[14]。近幾年發(fā)現(xiàn)的一種亮氨酰tRNA合成酶抑制劑在動物實驗中顯示出強于異煙肼的抑制結核分枝桿菌能力[15]。aaRS作為結核分枝桿菌抑制劑的作用靶標具有顯著的優(yōu)勢。在這里，我們介紹一種大量制備重組結核分枝桿菌精氨酰tRNA合成酶(MycobacteriumtuberculosisArginyl tRNA synthetase，MtArgRS)的方法。通過構建原核表達載體，在大腸桿菌中獲得了重組MtArgRS蛋白，通過生化試驗驗證了重組MtArgRS的蛋白折疊及其與天然底物的結合能力。通過篩選優(yōu)化獲得MtArgRS蛋白晶體。

1 材料與方法

1.1材料 pQE60質粒、M15大腸桿菌由河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院檢驗科保存。高保真DNA聚合酶、限制性核酸內切酶、T4 DNA連接酶、DNA marker購自Takara公司。質粒提取、凝膠回收試劑盒購自Axygen公司。引物及基因合成、測序在生工生物工程(上海)股份有限公司完成。青霉素、鏈霉素、IPTG購自索萊寶公司。Milipure超濾管、PEG3350、氯化鈉、氯化鎂等購自默克公司。HisPur Ni-NTA樹脂、蛋白質Marker購自Thermo Scientific。ATP、精氨酸、Sypro Orange購自Merck公司。結晶篩選試劑盒購自Hampton Research公司。

1.2方 法

1.2.1重組MtArgRS表達質粒的構建 根據(jù)GenBank登錄號NC_000962.3核酸序列，由睿博興科公司合成結核分枝桿菌ArgRS(MtArgRS)基因。使用PCR在MtArgRS基因兩端引入NcoI、BglII限制性核酸內切酶識別序列。瓊脂糖凝膠純化PCR產物，并使用NcoI、BglII限制性核酸內切酶消化PCR產物及pQE60質粒。消化產物經瓊脂糖凝膠再次純化后，MtArgRS基因與pQE60質粒以摩爾比5∶1混合后T4連接酶25 ℃連接2 h。連接產物轉化DH5α大腸桿菌，37 ℃過夜培養(yǎng)。使用菌落PCR鑒定陽性克隆后送公司測序，確認插入基因開放讀碼框是否正確。

1.2.2重組MtArgRS的制備 pQE60-MtArgRS重組質粒轉化M15大腸桿菌，構成重組菌pQE60-MtArgRS/M15。挑取單菌落接種到50 mL LB培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)。第2 d將培養(yǎng)物接種到2 L LB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)。在菌液濃度達到OD600=0.8時加入1 mmol/L IPTG，18 ℃過夜誘導表達。誘導后的菌液離心收集菌泥，菌泥重懸于含有500 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris pH8.0、1 mmol/L PMSF的裂解緩沖液中。超聲裂解后菌液經15 000 g離心45 min去除未破碎的細菌及不溶性顆粒，可溶性部分用Ni-NTA樹脂結合。首先用60 mL含有100 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris pH8.0、1 mmol/L PMSF緩沖液洗滌樹脂，然后用20 mL含20 mmol/L咪唑的相同緩沖液洗滌。隨后使用20 mL含300 mmol/L咪唑的緩沖液將結合樹脂的蛋白洗脫。使用截留分子量為30 kDa的Milipure超濾管把洗脫液濃縮到1.5 mL。濃縮液注入kta層析儀中，使用100 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris pH8.0、1 mmol/L DTT緩沖液進行色譜分離。使用SDS-PAGE蛋白電泳分析純化蛋白純度和蛋白分子量。使用截留分子量為30 kDa的Milipure超濾管濃縮重組MtArgRS。Nanodrop測量蛋白質濃度并調整蛋白濃度為10 mg/mL。50 μL分裝后液氮速凍，-80 ℃保存。

1.2.3重組蛋白圓二色譜分析 使用截留分子量為30 kDa的Milipure超濾管置換重組MtArgRS的緩沖液為pH8.0 PBS。在200 μL 10 mg/mL蛋白中加入15 mL pH8.0 PBS，混勻后超速離心濃縮蛋白到1 mL，再加入15 mL PBS，混勻后繼續(xù)離心濃縮，如此反復4次。重新使用nanodrop調整重組蛋白濃度為10 μmol/L。交替使用無水乙醇和去離子水清洗圓二色譜石英杯后加入重組蛋白。圓二色譜光譜數(shù)據(jù)在25 ℃下使用1 nm帶寬，197 nm至270 nm的1 nm步進分辨率獲得。

1.2.4MtArgRS與配體的結合分析 使用100 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris pH8.0緩沖液稀釋Sypro Orange到10×。將重組MtArgRS蛋白稀釋到20 nmol/L濃度，與含5 mmol/L ATP、精氨酸的混合液按照1∶1體積比混合，在冰上孵育15 min，然后與10× Sypro Orange按照1∶1體積比混合后冰上孵育15 min。Bio-Rad CFX實時定量PCR儀加熱程序設置如下：加熱溫度范圍20～80 ℃。從20 ℃起始，溫度每升高0.5 ℃，維持1 min后進行熒光信號檢測。使用Cal Gold540通道檢測Sypro Orange熒光信號。

1.2.5無配體MtArgRS結晶條件篩選 采用坐滴氣相擴散法對純化的MtArgRS進行晶體篩選，在20 ℃恒溫條件下培養(yǎng)。選擇Hampton Research公司的PEG/Ion、PEG/Ion2、Crystal Screen1、Crystal Screen2試劑盒，篩選初始結晶條件。調整重組MtArgRS蛋白濃度為10 mg/mL。在結晶孔腔內加50 μL結晶試劑，將蛋白質樣品與結晶試劑按1∶1比例混合于左側小孔，并將孔腔密封，置于恒溫柜中撫育晶體生長，顯微鏡下定期觀察晶體生長狀況。獲得初篩晶體后，對原始結晶條件進行微調，使用懸滴氣相擴散法進行更細致的結晶優(yōu)化，提高晶體質量，以獲得可以用于X射線衍射的晶體。

2 結 果

2.1重組基因載體的構建 按照pQE60載體的多克隆位點設計MtArgRS基因引物擴增MtArgRS基因。擴增結果如圖1，在1 500～2 000 bp DNA marker旁有一條亮帶，與MtArgRS基因大小近似。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳純化、限制性核酸內切酶消化后連接入pQE60載體中。重組質粒經測序驗證讀碼框完全正確。

M：GeneRuler 1 kb DNA Marker；1：ArgRS基因擴增產物

2.2MtArgRS重組蛋白的制備 誘導后的pQE60-MtArgRS/M15，經超聲破碎、Ni-NTA樹脂結合、洗脫、濃縮后，使用kta層析儀進一步純化。重組MtArgRS純化結果如圖2。MtArgRS的洗脫峰值是16.70 mL，洗脫峰呈對稱圖形，提示重組蛋白的結構均一，如圖2A所示。重組蛋白洗脫液經SDS-PAGE電泳驗證重組蛋白的純度達到分析純度，如圖2B。根據(jù)標準品的分子量及洗脫體積計算獲得的方程式為Y=7.900 35-0.186 09X。根據(jù)方程式計算重組MtArgRS的分子量為62 kDa，與MtArgRS的理論分子量60.83 kDa近似。使用Nanodrop的測定值除以重組蛋白的消光系數(shù)0.856，調整蛋白質的濃度為10 mg/mL，50 μL液氮凍存后-80 ℃保存。

A:重組MtArgRS和標準品的gel filtration chromatography洗脫峰，及重組MtArgRS與標準品分子量、洗脫體積的直線擬合；B:洗脫峰對應收集孔樣本的SDS-PAGE分析

2.3圓二色譜評價重組蛋白 根據(jù)已解析的大腸桿菌ArgRS晶體結構可知，ArgRS分子主要由α螺旋組成，含有少量的β層疊。為了評價大腸桿菌制備的重組MtArgRS折疊質量，使用圓二色譜對重組蛋白進行了評估，結果如圖3。在圓二色譜圖中可以看到在210～220 nm處有兩個最低吸收峰，符合α螺旋的吸收峰特性。這一結果提示重組MtArgRS分子中的主要組成結構α螺旋正確折疊。

圖3 MtArgRS的圓二色譜分析

2.4重組MtArgRS與底物及類似物結合的分析 為了驗證重組MtArgRS的生物活性，我們使用thermal shift assay(TSA)分析重組蛋白與天然底物的結合能力，結果如圖4。MtArgRS與天然底物ATP、Arg混合后，只有在底物ATP和Arg同時存在時可以使MtArgRS的熔融曲線發(fā)生右移，MtArgRS熱穩(wěn)定溫度升高2 ℃，底物單獨存在時不能引起MtArgRS熱穩(wěn)定性變化，結果如圖4A。對重組MtArgRS熱變性熔融曲線進行求導得到的熔融溫度峰值如圖4B，與同為aaRS家族的結核分枝桿菌甲硫氨酰tRNA合成酶相比MtArgRS有兩個峰值溫度分別是41 ℃和47.5 ℃。

A:MtArgRS與天然底物結合的TSA分析；B:MtArgRS與MtMetRS的熔融溫度峰值圖比較

2.5無配體MtArgRS結晶的獲得 利用蒸發(fā)擴散坐滴法進行晶體篩選，重組蛋白質濃度為10 mg/mL。通過坐滴法篩選了196種結晶條件，最終找到3種生長結晶條件，如圖5所示。結晶條件：圖5A晶體為0.02 mol/L 二水氯化鈣、20%w/v PEG 3350；圖5B晶體為0.01 mol/L六水氯化鎂、0.1 mol/L HEPES pH7.0、15% w/v PEG 3350；圖5C晶體為0.2 mol/L 氯化鈉、0.1 mol/L 醋酸鈉 pH4.6、30% v/v(+/-)-2-Methyl-2,4-pentanediol。對晶體生長條件進行優(yōu)化后，最終在0.01 mol/L 六水氯化鎂、0.1 mol/L HEPES pH7.6、10% w/v PEG 條件下獲得菱角分明的多面體晶體，如圖6所示，晶體外形較好，體積中等大小，完整度較高。

圖5 MtArgRS不同條件下的晶體形狀

圖6 優(yōu)化條件下的MtArgRS晶體形狀

3 討 論

抗感染藥研究和使用在臨床實踐中具有巨大的吸引力，是人類健康的一個重要領域。目前已經從天然物質中或通過篩選合成的方法鑒定到了許多特異性的aaRS抑制劑[16-18]。精氨酰tRNA合成酶是aaRS家族中的一員，屬于Ia亞型。目前對aaRS基因沉默的研究顯示，相對于其他aaRS家族成員，ArgRS基因的沉默可以使布氏錐蟲細胞快速死亡[19]。這顯示ArgRS對維持基本生命活動的重要性，因此也是非常重要的藥物靶標。結核分枝桿菌ArgRS與人胞質及線粒體中的ArgRS在氨基酸序列上的一致性僅有28.54%,存在著較大的差異，這也是針對結核分枝桿菌ArgRS設計高選擇性抑制劑的基礎。

到目前為止，對ArgRS結構與功能的研究主要局限在大腸桿菌ArgRS，其余病原體的ArgRS研究還未報道。本研究通過使用重組質粒在大腸桿菌中成功表達MtArgRS，并通過分子篩和生化試驗鑒定了重組MtArgRS的完整性和生物活性。重組MtArgRS的TSA試驗結果提示Arg或ATP單獨與MtArgRS結合的親和力低。這一點提示依據(jù)Arg或ATP結構設計的類似物可能達不到抑制其活性的能力。由于ArgRS蛋白可以催化Arg與ATP合成Arg-AMP及焦磷酸(PPi)。由此推斷同時加入ATP和Arg后引起ArgRS熱穩(wěn)定性增高的因素是Arg-AMP和PPi。Arg-AMP和PPi可以增強MtArgRS熱穩(wěn)定性這一現(xiàn)象提示，與Arg-AMP及PPi結構相似的化合物是MtArgRS抑制劑篩選的參考對象。此外，TSA實驗顯示ArgRS與MetRS具有不同的熔融溫度峰值，MtArgRS表現(xiàn)出兩個不同熔融溫度，相差6.5 ℃，這一特性推測可能和ArgRS是多結構域蛋白有關。而MtArgRS晶體的獲得為MtArgRS結構分析及抑制劑篩選提供了基礎。

本次研究中建立的重組MtArgRS的制備方法，為研究和篩選結核分枝桿菌抑制劑提供了基礎。

利益沖突：無