孫長云，黃天鵬，韋入豐，張 薇，鄧愛萍，彭曉放，曾靈風(fēng)，張少忠，黃元祥，武 婕

布魯氏菌病(簡稱布病)是由布魯氏桿菌感染而引起的一種具有傳染性的人獸共患病。該病可通過直接接觸受感染動(dòng)物或間接食用受污染的肉和乳制品等而發(fā)生。布病患者的主要臨床表現(xiàn)為低燒、夜間盜汗、關(guān)節(jié)及肌肉階段性疼痛等癥狀[1]。隨著廣東省經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人們的生活水平發(fā)生了實(shí)質(zhì)性的改變，對于肉類和奶制品等產(chǎn)品的需求量不斷增加。外地輸入的部分病畜未能及時(shí)進(jìn)行檢疫，混入市場，從而導(dǎo)致布病的暴發(fā)事件增加[2]。歷史上廣東省一直以豬種布魯氏菌病為主，自2006年以后轉(zhuǎn)變?yōu)楦吒腥拘缘难蚍N為主要種型，呈現(xiàn)出各地區(qū)布病病例逐漸遞增的發(fā)展趨勢[3]。布病不僅給地方畜牧業(yè)的發(fā)展造成嚴(yán)重影響，更重要的是給人們的生命健康帶來了嚴(yán)重的威脅[4]。

本研究收集2019年廣東省梅州市五華縣發(fā)生布病疫情的數(shù)據(jù)，并采集具有相關(guān)癥狀人群的血液進(jìn)行血清學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定，同時(shí)對可疑病羊的羊奶進(jìn)行分子生物學(xué)檢測。對血清學(xué)顯示陽性的病人血樣進(jìn)行布魯氏菌實(shí)驗(yàn)室分離與種型鑒定。為進(jìn)一步了解本次分離菌株與其他標(biāo)準(zhǔn)菌株各生物種型之間的關(guān)系，選取14株分離布魯氏菌株進(jìn)行了多位點(diǎn)序列分型(MLST)研究，從根源上了解此次布病疫情的暴發(fā)的原因，同時(shí)也為更好掌握廣東省布病疫情動(dòng)態(tài)和分析流行特征提供有力數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1資料來源 采集的血液樣本及羊奶樣本均來源于廣東省梅州市五華縣。布魯氏菌病病例的數(shù)據(jù)資料來源于廣東省急性傳染病監(jiān)測系統(tǒng)，主要包括病例的臨床癥狀和人群基本特征等。

1.2血清抗體檢測 無菌環(huán)境下，采集靜脈血2～3 mL，離心后獲得血清，經(jīng)虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)進(jìn)行初篩。初篩陽性者再通過試管凝集試驗(yàn)(SAT)進(jìn)行復(fù)核確認(rèn)。上述試驗(yàn)結(jié)果均依據(jù)布魯氏菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)，以RBPT陽性且SAT滴度≥1∶100判定為血清抗體陽性。

1.3分子生物學(xué)檢測

1.3.1引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)張輝等[5]報(bào)道的針對布魯氏桿菌外膜蛋白基因Omp22序列設(shè)計(jì)的特異性引物和參考細(xì)菌16S rRNA基因引物，委托上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列如表1。

1.3.2基因擴(kuò)增及測序 按照血液基因組DNA抽提試劑盒(TIANGEN，DP304)所述方法提取血液和羊奶的基因組DNA，并保存于-20 ℃以備后續(xù)試驗(yàn)使用。應(yīng)用表1合成的引物，以提取的血液和羊奶DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系均為50 μL：DNA模板4 μL，上游引物 2 μL，下游引物 2 μL，Premix Taq 25 μL，ddH2O 17 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃(Omp22基因)和56 ℃(16S rRNA基因)退火1 min，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物送廣州昊天生物科技有限公司進(jìn)行測序。

表1 布魯氏菌Omp22和16S rRNA基因引物序列

1.4布魯氏菌Omp22基因和16S rRNA基因序列遺傳進(jìn)化樹分析 測序結(jié)果結(jié)合GenBank中布魯氏菌的Omp22和16S rRNA參考序列進(jìn)行序列比對，通過生物學(xué)軟件Mega 6.0應(yīng)用鄰位相連法(Neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[6]。

1.5病原菌的分離與常規(guī)方法鑒定 無菌條件下，共計(jì)采集血液樣品18份，無菌操作接種至血培養(yǎng)瓶。帶回生物安全三級實(shí)驗(yàn)室后轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)箱中進(jìn)行可疑菌的分離與培養(yǎng)。對分離的可疑菌分別進(jìn)行單因子血清凝集試驗(yàn)、染料抑菌試驗(yàn)和噬菌體裂解試驗(yàn)。具體操作步驟參考國家布魯氏菌鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行[7]。

1.6AMOS-PCR分型鑒定 AMOS-PCR根據(jù)姜海等[8]報(bào)道，選取AMOS-PCR引物序列并委托上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列如表2。AMOS-PCR擴(kuò)增擴(kuò)增體系: 2×Premix Taq 10 μL; 引物 IS711(10 pmol/μL)1 μL; 引物 A、M、O、S(10 pmol/μL)各0.4 μL; 模板DNA 2 μL，ddH2O 5.4 μL。AMOS-PCR擴(kuò)增條件: 95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min;最終延伸 72 ℃ 5 min, 35個(gè)循環(huán)。待擴(kuò)增完畢，PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測并觀察結(jié)果。

表2 AMOS-PCR引物序列

1.7MLST分型 將14株布魯氏菌全基因測序文件在數(shù)據(jù)庫(https://pubmlst.org/)中查找到21個(gè)基因片段，包括布魯氏菌19個(gè)管家基因(acnA、aroA、cobQ、csdB、ddlA、dnaK、gap、gyrB、leuA、mviM、prpE、soxA、trpE、caiA、fbaA、fumC、glk、mutL、putA)、1個(gè)外膜蛋白基因(omp25)和1個(gè)基因間區(qū)Int-hyp共21個(gè)基因片段作為MLST的靶標(biāo)基因。使用 Bio Numerics(Version 6)將14株分離菌株與11株標(biāo)準(zhǔn)株和10株文獻(xiàn)參考株用平均連鎖聚類法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析，探討各菌株間的進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1發(fā)病情況 本次疫情病例均居住在梅州市五華縣華陽鎮(zhèn)，主要分布在4個(gè)自然村，包括坪南、太坪、葉新和華南地區(qū)，其中坪南村和太坪村病例人數(shù)最多，占總病例的90%(27/30)。坪南村罹患率最高達(dá)32.67/萬，如表3所示。

表3 梅州市五華縣暴發(fā)布病疫情各地區(qū)的病例分布

2.2臨床特征 本次疫情病例的臨床表現(xiàn)主要是發(fā)熱、乏力、多汗和肌肉關(guān)節(jié)酸痛等癥狀，其中70%都有發(fā)熱的癥狀。具體如表4所示。

表4 梅州市五華縣布病暴發(fā)疫情病例臨床表現(xiàn)

2.3血清抗體檢測 本次共采集了277個(gè)村民的血樣，經(jīng)RBPT初篩后有30份血清顯示陽性反應(yīng)。隨后對這30份血清進(jìn)行SAT試驗(yàn)，結(jié)果顯示30份血清SAT滴度均≥1∶100，可以初步確定有30例布魯氏菌病陽性患者。

2.4布魯氏菌的16S rRNA基因序列遺傳進(jìn)化樹結(jié)果 根據(jù)布魯氏菌的16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可見，從血液和羊奶中分離到的布魯氏菌16S rRNA基因序列可聚類在同一進(jìn)化分支上，并能夠很好的聚類。同時(shí)，來自血液和羊奶中檢測到布魯氏菌的16S rRNA基因序列與布魯氏菌的標(biāo)準(zhǔn)參考菌株序列聚類在同一末端分支，而與其它菌株的16S rRNA基因序列相距較遠(yuǎn)(圖1)。

圖1 基于布魯氏菌16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.5布魯氏菌的Omp22基因序列遺傳進(jìn)化樹結(jié)果 根據(jù)布魯氏菌的Omp22基因構(gòu)建的進(jìn)化樹可見，在血液和羊奶中檢測到的Omp22基因序列聚類在同一末端進(jìn)化分支上，與來自新疆地區(qū)的參考序列聚類在同一分支上，但與西班牙、德國和印度的分離株相距較遠(yuǎn)(圖2)。

圖2 基于布魯氏菌Omp22基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.6細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果 在采集的18份血樣中分離到14份有可疑菌落，菌落特征為無色半透明、濕潤、邊緣光滑、無色透明、呈針尖狀。經(jīng)革蘭染色菌體呈紅色短桿菌，柯氏染色菌體也呈紅色短桿菌狀。上述結(jié)果均符合布魯氏菌的菌落形態(tài)和細(xì)菌形態(tài)特征。

2.7AMOS-PCR鑒定結(jié)果 AMOS-PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，14株分離菌株均可在731 bp大小處出現(xiàn)目的片段，與陽性對照組中的羊種布魯氏菌處在相同位置，可判定14株分離菌株均為羊種布魯氏菌(圖3)。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-14：分離菌株；N：陰性對照；15：羊種菌；16：牛種菌；17：豬種菌

2.8種型鑒定結(jié)果 對分離的布魯氏菌進(jìn)行CO2需求、H2S產(chǎn)生、血清凝集反應(yīng)、噬菌體裂解和染料抑菌試驗(yàn)，結(jié)果顯示14份布魯氏菌均為羊種3型菌株，表現(xiàn)為：CO2(-)、H2S(-)、單項(xiàng)特異性血清凝集A(+)M(+)R(-)、染料抑菌硫堇和堿性復(fù)紅(+)、噬菌體裂解BK2(+)Tb(-)104Tb(-)。見表5。

表5 布魯氏菌的種型鑒定結(jié)果

2.9MLST分型結(jié)果 經(jīng)MLST聚類分析發(fā)現(xiàn)，本次疫情分離到的14株布魯氏菌可聚類在同一個(gè)進(jìn)化分支上，并與羊種布魯氏菌聚類在同一個(gè)進(jìn)化分支末端。其次，14株分離株與各標(biāo)準(zhǔn)生物型的布魯氏菌的相似值介于82.0%～100.0%(圖4)。

圖4 廣東省梅州市14株羊種布魯氏菌MLST聚類分析

3 討 論

布病因其對人類的危害大，且近幾年呈現(xiàn)出疫情擴(kuò)大的趨勢，越來越受到重視。盡早的診斷布病是該病的防控關(guān)鍵，布魯氏菌作為該病的病原體，由于初次分離培養(yǎng)時(shí)生長較為緩慢，應(yīng)用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)鑒定不利于早期的診斷，但分子生物學(xué)檢測技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢[9]。目前文獻(xiàn)中報(bào)道PCR檢測布魯氏菌的方法很多，在布魯氏菌屬水平的檢測一般選用單對引物PCR，其中主要是以外膜蛋白Omp22、Bcsp31和IS711等的編碼基因設(shè)計(jì)引物[5,10]。而在種及生物型水平的鑒定則選用多對引物的多重PCR方法，比如AMOS-PCR和多位點(diǎn)序列分型(MLST)等[8,11]。本研究在病例的血液和羊奶樣本中均檢測到了布魯氏菌Omp22基因和16S rRNA基因，表明羊奶和病例的血液中均存在布魯氏菌。經(jīng)測序Omp22基因序列比對后結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羊奶中的病原與血液中的布魯氏菌序列相同，提示本次布魯氏菌病疫情由生飲鮮羊奶所致。經(jīng)布魯氏菌16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，分離株與標(biāo)準(zhǔn)參考菌株聚集在同一末端分支，進(jìn)化程度趨同，遺傳距離相似，無法辨別菌株間遺傳關(guān)系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明16S rRNA不宜做布魯氏菌遺傳進(jìn)化分析的靶基因，但可在屬水平準(zhǔn)確的鑒定布魯氏菌，這與已有研究結(jié)果相似[12]?；谏鲜鰡栴}，對Omp22基因構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示，本次檢測的羊奶和人血液中擴(kuò)增的布魯氏菌Omp22基因在同一個(gè)進(jìn)化分支上，而且同新疆地區(qū)的分離菌株相距較近，但與西班牙、德國和印度的分離株相距較遠(yuǎn)，提示此次布病疫情可能非進(jìn)口羊所致，而可能與國內(nèi)擴(kuò)散性較高的羊型布魯氏菌有關(guān)。

近年來，廣東省人間布病疫情呈逐年上升趨勢，每年都有患者中分離到布魯氏菌菌株的案例[13]。此前，梅州市五華縣從未有布病的流行報(bào)道，而隨著該地區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人們生活水平的不斷提高，奶食品也成為了人們生活中重要的營養(yǎng)品之一。羊奶營養(yǎng)豐富，其中干物質(zhì)和能量含量比牛奶稍高，非常適宜中老年人和嬰幼兒飲用[14]。當(dāng)?shù)氐牟糠执彘_發(fā)了小型家庭式山羊養(yǎng)殖場，為附近的村民提供了羊奶的供應(yīng)需求。當(dāng)?shù)匮蛑坏慕灰字饕峭ㄟ^流動(dòng)式貨車不定點(diǎn)銷售，交易也較為隱蔽，由于經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，從疫區(qū)購入的未檢疫的羊也混入其中，從而導(dǎo)致當(dāng)?shù)夭疾∫咔榈陌l(fā)生。再加之銷售方及居民對布病的認(rèn)知不足，從擠奶到包裝都未進(jìn)行有效的消毒處理，而且當(dāng)?shù)卮蠖鄶?shù)居民有進(jìn)食生鮮羊奶的習(xí)俗，這也導(dǎo)致了本次布病疫情的暴發(fā)流行。在本疫情中發(fā)現(xiàn)，生飲染疫羊生鮮羊奶的114人中，共有30人經(jīng)確診為布病陽性病例，而飲用煮沸的染疫羊生鮮羊奶的112人均未發(fā)現(xiàn)布病陽性病例。這進(jìn)一步明確了此次疫情暴發(fā)流行的根源，為我們疫情的追蹤和控制提供了有力數(shù)據(jù)。

本次疫情有30人的血清虎紅平板試驗(yàn)顯示陽性，期間成功采集到18人的全血進(jìn)行布魯氏菌分離試驗(yàn)，剩余12人赴醫(yī)院就診，未能成功采集到全血樣本。隨著感染者全血中布魯氏菌的成功分離，通過AMOS-PCR的結(jié)果初步分析發(fā)現(xiàn)，本次的分離菌株均屬于羊種布魯氏菌。種型鑒定確定分離的布魯氏菌均屬于羊種3型布魯氏菌。這與陳經(jīng)雕等報(bào)道的廣東省的布魯氏菌株已經(jīng)由豬種3型流行菌株轉(zhuǎn)變?yōu)檠蚍N3型流行株一致[15]。本研究采用MLST進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)本次疫情分離到的14株布魯氏菌聚類在同一個(gè)進(jìn)化分支上，并且與布魯氏菌各標(biāo)準(zhǔn)株之間相似度為82.0%～100.0%。從MLST進(jìn)化分支中發(fā)現(xiàn)，所有菌株在100.0%相似值水平上可分為13種ST型別，其中2株布魯氏菌分離株(菌株編號為LB-127和LB-132)與來自內(nèi)蒙古地區(qū)的ASM42086V1菌株ST型處于同一分支上，其余12株布魯氏菌分離株與羊種參考菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株聚類在同一ST型進(jìn)化分支上。以上有關(guān)MLST分析結(jié)果提示，本次疫情分離到的14株布魯氏菌分離株，與羊種2型和羊種3型布魯氏菌的親緣關(guān)系最為相近，且與內(nèi)蒙古地區(qū)參考菌株存在100%同源關(guān)系，可能是本次布病疫情的溯源地。本研究在生物分型的基礎(chǔ)上結(jié)合MLST分型技術(shù)可以更好地對布魯氏菌進(jìn)行流行病學(xué)溯源調(diào)查和進(jìn)一步明確菌株之間的遺傳關(guān)系[16]。家庭式山羊養(yǎng)殖場的不斷擴(kuò)大，可能是造成廣東省布病疫情呈逐年上升的主要原因。加強(qiáng)畜間布病疫情的監(jiān)測、增強(qiáng)對進(jìn)出省羊只的布病專項(xiàng)免疫、提高群眾對布病的認(rèn)知和防范意識(shí)是防控布病疫情的有效措施。

利益沖突：無