李婷婷，陳春艷,2，余 斕,3，丁偉艷，丁 楠，李水紅，朱翠明

社區(qū)獲得性肺炎(CAP)是一種常見的呼吸系統(tǒng)感染性疾病。5歲以下兒童死因中，約16%由CAP所致[1]。肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae，Mp)是社區(qū)獲得性肺炎最主要的病原體之一，在兒童和青少年中，10%～30%的CAP是由Mp感染所致，流行期間可達(dá)30%～50%[2-3]。除CAP外，Mp感染還與支氣管哮喘的發(fā)病密切相關(guān)，并可引起腦膜腦炎、心肌炎、動(dòng)脈粥樣硬化等肺外感染和并發(fā)癥[4-5]。

生物被膜(Biofilm，BF)是細(xì)菌在生長過程中為適應(yīng)環(huán)境而形成的一種生存狀態(tài)。BF的形成增強(qiáng)了細(xì)菌的黏附活性，阻擋了抗生素、抗體、補(bǔ)體等對細(xì)菌的殺傷。此外，BF內(nèi)的細(xì)菌較浮游細(xì)菌彼此之間更易進(jìn)行信號傳遞、毒力基因及耐藥基因的捕獲和轉(zhuǎn)移[6]。包括Mp在內(nèi)的很多支原體在生長過程中可形成BF[7-9]。但目前關(guān)于MpBF的研究很少，除Kornspan JD等確定主要黏附蛋白P1是MpBF的組分之一[9]；Simmons WL的研究顯示過氧化氫酶可促進(jìn)MpBF的生長和產(chǎn)生[10]，此外，目前尚無其他MpBF組成和調(diào)節(jié)機(jī)制的研究。

S-腺苷甲硫氨酸(S adenosyl methionine, SAM)合成酶是SAM在生物體內(nèi)合成的關(guān)鍵限速酶，廣泛存在動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)。SAM 合成酶催化 ATP 和 L-甲硫氨酸反應(yīng)生成SAM，后者作為甲基供體參與多種重要反應(yīng)。在甲基循環(huán)中，SAM提供甲基，使得甲基循環(huán)中生成自誘導(dǎo)物-2(Autoinducer-2，AI-2)[11]，AI-2是群體感應(yīng)(quorum sensing, QS)系統(tǒng)的主要信號分子，可促進(jìn)BF的形成。已有研究發(fā)現(xiàn)，雞毒支原體的SAM合成酶可參與BF的形成[12]。本文初步研究Mp SAM合成酶在BF形成中的作用，為了解MpBF的形成及尋找抗MpBF的制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 支原體液體培養(yǎng)基CM403和固體培養(yǎng)基CM401購自O(shè)xoid公司。西奈芬凈(sc-203263)為Santa Cruz Biotechnology產(chǎn)品；迷迭香酸為Sigma公司產(chǎn)品；UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒(SK1321)購自上海生物工程公司；SuperReal 彩色熒光定量預(yù)混試劑和細(xì)菌全基因組DNA提取試劑盒為Tiangen產(chǎn)品；結(jié)晶紫購自湘中地質(zhì)實(shí)驗(yàn)研究所。

1.2菌株來源和分離及鑒 Mp M129菌株(ATCC 29342)為南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所保存。22株Mp 臨床菌株由課題組在2016年1月至2018年12月從南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科呼吸道感染患兒咽拭子標(biāo)本中分離培養(yǎng)鑒定[13]。

1.3MpBF觀察 參照參考文獻(xiàn)[7-9]對M129及22株Mp臨床菌株進(jìn)行BF培養(yǎng)，具體如下：24孔板中置入無菌圓玻片，每孔加入1 mL 含1×105顏色變化單位(CCU)的Mp，設(shè)置只加培養(yǎng)基孔為對照。37 ℃ 靜置培養(yǎng)5～7 d，取出圓玻片，用PBS輕輕沖洗3次，置于培養(yǎng)皿中，加100 μL 10 g/L的結(jié)晶紫溶液染色15 min，吸去染色液，無菌水清洗3次，在光學(xué)顯微鏡下觀察MpBF 形成情況。

1.4BF半定量分析 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔中加入200 μL 1×105CCU/mL Mp菌液，滴加滅菌液體石蠟后于37 ℃培養(yǎng)5～7 d至Mp生長。輕輕移去上清液，用PBS清洗3次，甲醇固定30 min后晾干，用100 μL 0.5%的結(jié)晶紫溶液染色30 min，無菌水洗滌3次后自然晾干，每孔加入200 μL 無水乙醇脫色10 min，酶標(biāo)儀測定570 nm波長處吸光值。實(shí)驗(yàn)單個(gè)樣本均設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR 采用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒，按說明提取Mp 總 RNA。取 200 ng RNA 用于實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄 PCR(quantitative Real-time RT-PCR, qRT-PCR)。metX基因引物為: 5′-GTTTGGGTTGAGCGGAAGA-3′和 5′-CCAAAGTGACCGTAAACAGCA-3′。用Mpmpn665基因作為內(nèi)參，其引物為：5′-TCCCTACCAGAAAACACCGA-3′和5′-CACGG-ATGGAGAACTTACTACCT-3′。在ABI Stepone plus型熒光定量PCR儀 進(jìn)行如下反應(yīng)：95 ℃ 3 min 后，進(jìn)入 95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)45次。以所得的數(shù)據(jù)與內(nèi)參之比作為相對值。

1.6西奈芬凈和迷迭香酸對MpBF形成的影響 將1×105CCU/mL浮游狀態(tài)的M129株分別接種于含10～50 μg/mL西奈芬凈和0.5～10 μmol/L的CM403液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)5 d后結(jié)晶紫染色半定量測定BF形成量，qRT-PCR檢測metX的mRNA。

2 結(jié) 果

2.1結(jié)晶紫染色觀察MpBF M129菌株分別進(jìn)行振動(dòng)和靜置培養(yǎng)5 d，結(jié)晶紫染色后光學(xué)顯微鏡觀察，靜置培養(yǎng)的M129株可見淡紫色網(wǎng)絡(luò)樣團(tuán)塊膜狀物，而振動(dòng)培養(yǎng)僅見散在分布的較小膜狀物(圖1)。

圖1 結(jié)晶紫染色觀察M129株振動(dòng)和靜置培養(yǎng)5 d后的BF的形成

2.2MpBF形成呈時(shí)間依賴性 分別靜置和振動(dòng)培養(yǎng)M129菌株，半定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明M129菌株在靜置培養(yǎng)第5 d時(shí)BF的形成量相對最高。振動(dòng)培養(yǎng)無明顯BF形成(圖2)。

①：P<0.05；②：P<0.01

2.3Mp臨床株BF半定量分析 對23株Mp菌株進(jìn)行BF半定量分析，結(jié)果顯示，與振動(dòng)培養(yǎng)組比較，13株Mp(56.5%，13/23)的BF形成量顯著增高(tM129標(biāo)準(zhǔn)株=28.91，tM119=17.46，tM99=27.05，tM28=7.49，tM134=17.46，tM17=13.78，tM15=12.90，tM42=13.87，tM82=29.42，tM21=14.99，tM71=14.15，tM118=13.73，tM34=8.80，P<0.05)；10株(43.5%，10/23)Mp的BF形成量與振動(dòng)培養(yǎng)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tM120=3.03，tM122=1.54，tM10=3.59，tM101=3.35，tM126=3.40，tM4=3.35，tM9=3.40，tM49=3.86，tM100=4.61，tM132=1.49，P>0.05)(圖3)。

①: 與振動(dòng)培養(yǎng)比較，P<0.05

2.4metXmRNA在BF形成能力不同的Mp菌株的相對轉(zhuǎn)錄水平 分別挑選3株不能形成BF的Mp株(M120、M122、M132)和3株形成BF能力強(qiáng)的Mp株(M129、M82、M99)，qRT-PCR檢測其靜置培養(yǎng)5 d后SAM合成酶基因(metX)的mRNA相對表達(dá)水平。結(jié)果表明3株形成BF能力強(qiáng)的Mp株metX基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于不能形成BF的菌株(P<0.05)(圖4)。

①：與不能形成BF的菌株比較，P<0.05

2.5西奈芬凈和迷迭香酸對MpBF的作用呈濃度依賴性 將Mp分別接種于含不同濃度西奈芬凈或迷迭香酸的CM403培養(yǎng)基，5 d后結(jié)晶紫染色半定量分析結(jié)果顯示，與對照未處理組比較，10～50 μg/mL的西奈芬凈均能顯著減少M(fèi)pBF的形成。0.5～5.0 μmol/L的迷迭香酸均可促進(jìn)MpBF的產(chǎn)生，以2.0 μmol/L 迷迭香酸刺激產(chǎn)生的MpBF最多。10.0 μmol/L可顯著減少M(fèi)pBF的形成，因?yàn)楦邼舛鹊拿缘闼嵊锌咕饔?，可抑制Mp的生長繁殖(圖5)。

A：西奈芬凈處理；①：10～50μg/mL西奈芬凈處理vs未處理，P<0.05；B：迷迭香酸處理；②：0.5～5.0μmol/L迷迭香酸處理vs未處理，P<0.05

2.6西奈芬凈和迷迭香酸對MpBF形成的作用 30 μg/mL西奈芬凈處理3株BF形成能力強(qiáng)的菌株(M129、M99、M82)，5 d后結(jié)晶紫染色半定量檢測BF形成，發(fā)現(xiàn)3株Mp的BF形成量均較未處理組顯著減少(tM129=13.80,P<0.01;tM82=5.261,P<0.05;tM99=12.35，P<0.01)。將3株不能或形成BF能力弱的Mp株(M120、M122、M132)在含2.0 μmol/L的迷迭香酸中培養(yǎng)5 d后，半定量檢測結(jié)果顯示，此3株Mp形成的BF量均較對照未處理組顯著增加(tM120=6.279,P<0.05;tM122=81.86,P<0.01;tM132=5.063，P<0.05)(圖6)。

A：西奈芬凈處理；B：迷迭香酸處理；①：處理組vs未處理，P<0.05

2.7西奈芬凈和迷迭香酸處理后metX轉(zhuǎn)錄水平改變 30 μg/mL西奈芬凈作用于3株BF形成能力強(qiáng)的Mp菌株后，qRT-PCR檢測未處理菌株和西奈芬凈處理菌株metXmRNA相對表達(dá)水平，結(jié)果顯示3株西奈芬凈處理菌株metXmRNA相對表達(dá)水平均較未處理組顯著減少(tM129=12.05,P<0.01;tM82=11.88,P<0.01;tM99=8.682，P<0.05)。2.0 μmol/L的迷迭香酸刺激3株BF形成能力弱(或不能形成BF)的Mp菌株后，其metXmRNA的轉(zhuǎn)錄水平均較對照未處理組顯著增加(tM120=4.953,P<0.05;tM122=5.939,P<0.05;tM132=9.156，P<0.05)(圖7)。

A：西奈芬凈處理；B：迷迭香酸處理；①：處理組vs未處理，P<0.05

3 討 論

細(xì)菌黏附在有生命或無生命材料表面后，細(xì)菌及其分泌的胞外多糖、DNA和蛋白質(zhì)等一起形成BF。BF是細(xì)菌普遍的生存狀態(tài)，超過80%的人類細(xì)菌感染是由BF引起的[14]。我們檢測了23株Mp體外形成BF的能力，結(jié)果顯示在細(xì)胞培養(yǎng)板上靜置培養(yǎng)5 d后Mp形成的BF最多。23株Mp中有13株(56.5%)可在96孔培養(yǎng)板中形成較強(qiáng)的BF，10株Mp(43.5%)不能形成BF或形成BF的能力弱。

BF形成過程中，大約50%的蛋白發(fā)生改變，BF菌中多種黏附蛋白、糖蛋白、應(yīng)激蛋白和纖維蛋白等的表達(dá)較浮游菌顯著上調(diào)。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MpBF形成能力強(qiáng)的菌株中SAM合成酶基因(metX)的表達(dá)水平顯著高于BF形成能力弱的菌株，表明SAM合成酶可能參與MpBF的形成。SAM合成酶可能是通過催化生成QS系統(tǒng)的前體物質(zhì)SAM，促進(jìn)AI-2的分泌，增強(qiáng)群體感應(yīng)而促進(jìn)MpBF形成。

西奈芬凈是一種腺苷衍生物，其結(jié)構(gòu)與SAM類似但無甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，可抑制DNA、RNA、蛋白和其他分子的轉(zhuǎn)甲基化反應(yīng)[15]，減少AI-2的合成，進(jìn)而減少群體感應(yīng)而抑制BF形成。Yadav MK發(fā)現(xiàn)西奈芬凈可抑制肺炎鏈球菌BF的形成[16]。我們用西奈芬凈處理Mp后發(fā)現(xiàn)BF 的形成減少，且metXmRNA的相對轉(zhuǎn)錄水平亦顯著降低。迷迭香酸是革蘭氏陰性菌的QS信號分子，功能類似于高絲氨酸內(nèi)酯，能促進(jìn)QS系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)和BF的形成[17]。我們用迷迭香酸刺激Mp后，發(fā)現(xiàn)其BF形成量增加，且metXmRNA的相對表達(dá)量亦顯著增加。這些結(jié)果進(jìn)一步表明SAM合成酶參與MpBF的形成。SAM合成酶有望成為研發(fā)MpBF抑制劑的靶點(diǎn)。

目前兒科治療Mp感染首選大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，但近年來，我國80%以上的Mp分離株對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥[18-19]。BF的形成是導(dǎo)致Mp對抗生素形成高度耐藥和多重耐藥的重要原因之一，研發(fā)有效的抗MpBF的藥物有重要意義。西奈芬凈是從灰質(zhì)鏈霉菌中分離出來的藥物，有抗真菌和抗惡性瘧原蟲、利什曼原蟲等寄生蟲的作用[15,20]，最近發(fā)現(xiàn)其對寨卡病毒和SARS-Cov-2也有明顯的抑制作用[21-22]。但在進(jìn)行西奈芬凈抗寄生蟲實(shí)驗(yàn)時(shí), 發(fā)現(xiàn)其對犬和山羊具有毒性, 故未在臨床上推廣應(yīng)用[23]。本研究發(fā)現(xiàn)西奈芬凈可顯著抑制MpBF的形成，因此，若以西奈芬凈為基礎(chǔ)，研發(fā)出新的、無明顯毒副作用的抗MpBF制劑可為Mp感染的治療提供有效藥物。

利益沖突：無