張會萍，張 萍，牛 春

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司, 銀川 750100)

多拉菌素(Doramectin)20世紀 90年代由美國輝瑞公司研制開發(fā)的新一代大環(huán)內(nèi)酯類抗寄生蟲藥，化學名稱為 25-環(huán)己烷基-5-O-去甲基-25-去(1-甲基丙酸)阿維菌素B1，分子式為 C50H74O14，分子量為 899.11，易溶于有機溶劑，如甲醇、乙醇、丙酮、二甲基亞砜、乙酸乙脂、乙酸異丙酯和己烷等有機溶劑[1-2]。多拉菌素是阿維鏈霉菌突變株在發(fā)酵過程中添加環(huán)己烷羧酸得到的產(chǎn)物[3]，抗寄生蟲的范圍更廣，效果更明顯，預防寄生蟲再感染的時間更長，多拉菌素對畜禽的毒性較小，安全性更好，對環(huán)境友好[4]，是阿維菌素類抗生素中最據(jù)開發(fā)潛力的抗寄生蟲獸用藥[5]。

對多拉菌素出發(fā)菌進行常溫室壓等離子(ARTP)誘變、紫外(UV)誘變和ARTP+UV復合誘變，篩選出一株高效價的多拉菌素突變株，又對該突變株進行發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化，包括培養(yǎng)溫度，發(fā)酵裝量，種齡，培養(yǎng)時間等進行優(yōu)化，菌株的生產(chǎn)能力和遺傳穩(wěn)定性都有很大的提升，為以后工業(yè)化生產(chǎn)提供可靠的工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 出發(fā)菌株RDL19-1(效價為270 μg/mL)，由寧夏泰瑞制藥股份有限公司菌種保藏室保藏。

1.1.2 主要試劑和儀器 主要試劑：多拉菌素標準品(純度≥99%)，環(huán)己烷甲酸(分析純，≥99%)，蔗糖(分析純)，硫酸鎂(分析純)，磷酸二氫鉀(分析純)

主要儀器：ARTP誘變系統(tǒng)ARTP-2-026，北京思清源科技有限公司；PHS-3C酸度計，上海精密科學儀器有限公司；紫外誘變箱和78-1型磁力攪拌器，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；LC-20AT型高效液相色譜儀，日本島津公司；BSA3202S-CW型電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司；超凈工作臺，無錫市榮豐凈化空調(diào)設(shè)備廠；XG1-Y型普通臥式壓力蒸汽滅菌器，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；DHZ-2001B恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；AS3120A型超聲波清洗機。

1.1.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

1.1.3.1 培養(yǎng)基 斜面及分離培養(yǎng)基：蔗糖、可溶性淀粉、瓊脂粉，pH7.0。

種子培養(yǎng)基：玉米淀粉、黃豆餅粉、棉籽餅粉，pH7.1-7.3。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉、黃豆餅粉、棉籽餅粉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、碳酸鈣、微量元素，pH7.1-7.3。培養(yǎng)基滅菌條件均為121 ℃，30 min。

1.1.3.2 培養(yǎng)條件 斜面培養(yǎng)：培養(yǎng)溫度28±1 ℃，培養(yǎng)時間8 d。

種子培養(yǎng)：取長勢良好的斜面，做成單孢子懸液，接入種子培養(yǎng)基中，種瓶裝量為30 ml(300 ml三角瓶)，培養(yǎng)溫度28±1 ℃，搖床轉(zhuǎn)速240 rpm/min，培養(yǎng)時間20～36 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液在無菌條件下轉(zhuǎn)入發(fā)酵瓶中，搖瓶裝量為30 mL(300 mL三角瓶)，接種量為10%，培養(yǎng)溫度28±1 ℃，搖床轉(zhuǎn)速240 rpm/min，培養(yǎng)時間12-15 d。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的制備 吸取10 mL無菌生理鹽水到培養(yǎng)好的新鮮斜面中，用無菌的鏟子刮洗斜面孢子，將洗脫液移入無菌的裝有玻璃珠的三角瓶中，震蕩5 min打散，用塞有二層擦鏡紙的無菌漏斗過濾菌懸液到EP管中，得到單孢子懸液待用。

1.2.2 常壓室溫等離子(ARTP)誘變處理[6]將無菌鐵片裝在無菌培養(yǎng)皿中，在超凈工作臺中吸取20 μL菌懸液滴在無菌鐵片上，用無菌鑷子夾取鐵片放入ARTP誘變系統(tǒng)的載物臺上，誘變參數(shù)為：電源功率100 W，氦氣流量10 L/min，照射距離2 mm。分別照射10、20、30、40、50和60 s，照射結(jié)束后將鐵片夾入裝有5 mL無菌生理鹽水的EP管中避光存放，洗脫菌體，吸取1 mL洗脫液用無菌生理鹽水按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀釋，取0.1 mL稀釋液涂布雙碟，28±1 ℃避光培養(yǎng)，稀釋未誘變的菌懸液涂布雙碟作為對照組，單菌落計數(shù)，計算ARTP不同照射時間的致死率和正突變率(菌株效價對照菌株20%即為正突變)，挑取單菌落斜面進行搖瓶初篩，選育高產(chǎn)菌株。

1.2.3 紫外(UV)誘變處理[7]在裝有磁力攪拌轉(zhuǎn)子的無菌培養(yǎng)皿中加入5 mL菌懸液，黑暗處15 W紫外燈下，距離30 cm處分別照射30、60、90、120、150和180 s，吸取1 mL照射后的孢子懸液用無菌生理鹽水按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀釋，取0.1 mL涂布平板，28±1 ℃避光培養(yǎng)，稀釋未誘變的菌懸液涂布雙碟作為對照組，計算紫外照射不同時間的致死率和正突變率(菌株效價對照菌株20%即為正突變)，挑取單菌落斜面進行搖瓶初篩，選育高產(chǎn)菌株。

1.2.4 ARTP-UV 復合誘變處理[8]吸取20 μL菌懸液到無菌鐵片上，ARTP-W100照射30 s，誘變后將鐵片放入裝有5 mL無菌生理鹽水的EP管中避光存放，洗脫菌體后，吸取5 mL菌懸液到裝有磁力攪拌轉(zhuǎn)子的無菌培養(yǎng)皿中，在15 W紫外燈距離30 cm處攪拌照射120 s，稀釋菌懸液涂布平板，在28±1 ℃避光培養(yǎng)，計算致死率和正突變率(菌株效價對照菌株20%即為正突變)，未誘變的菌懸液涂布雙碟作為對照組，挑取單菌落斜面進行搖瓶初篩，篩選高產(chǎn)菌株。

1.2.5 復篩 根據(jù)初篩結(jié)果選取效價高的斜面進行復篩，種子液以10%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵瓶，在溫度28±1 ℃，轉(zhuǎn)速240 rpm/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)12 d，培養(yǎng)結(jié)束后用高效液相色譜法測定多拉菌素效價。

1.2.6 遺傳穩(wěn)定性 復篩選出的高產(chǎn)菌株進行連續(xù)5代的傳代培養(yǎng)，發(fā)酵搖瓶檢測效價，驗證高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.7 甘油管保藏法 用20%的甘油與孢子懸液1∶1混合制備甘油管，冷凍于-20 ℃冰箱保存。

1.2.8 HPLC測定

1.2.8.1 樣品處理方法 吸取1 mL發(fā)酵液，加入4 mL甲醇，超聲10 min，靜置過夜，3000 r離心，吸取上清液進行 HPLC檢測。

1.2.8.2 高效液相色譜條件 LC-20AT型高效液相色譜儀；C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長245 nm；流動相為甲醇∶乙腈∶水(體積比)810∶10∶120；進樣20 μL；流速1 mL/min；根據(jù)積分面積，對照多拉菌素標準品曲線計算多拉菌素產(chǎn)量。

2 多拉菌素高產(chǎn)菌發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1 發(fā)酵溫度試驗 分別在25 ℃、28 ℃、30 ℃對多拉菌素進行發(fā)酵搖瓶，其他條件不變，培養(yǎng)結(jié)束后測定多拉菌素的產(chǎn)量，確定最佳發(fā)酵溫度。

2.2 發(fā)酵搖瓶裝量試驗 300 mL搖瓶分別裝量25、30、35、40、50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，其他條件不變，培養(yǎng)結(jié)束后測定多拉菌素的產(chǎn)量，判斷發(fā)酵搖瓶裝量對多拉菌素的產(chǎn)量的影響，確定最佳發(fā)酵搖瓶裝量。

2.3 種齡實驗 將培養(yǎng)16、24、32、40、48 h的種子液以10%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵搖瓶中，進行發(fā)酵培養(yǎng)，其他條件不變，培養(yǎng)結(jié)束后測定多拉菌素的產(chǎn)量，確定種子培養(yǎng)的最佳時間。

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)時間對多拉菌素產(chǎn)量的影響 種子液轉(zhuǎn)入發(fā)酵瓶后，發(fā)酵瓶分別培養(yǎng)12、13、14、15 d放瓶檢測多拉菌素的效價，確定最佳放瓶周期。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌種誘變結(jié)果

3.1.1 ARTP誘變的作用結(jié)果 原始菌株經(jīng)ARTP誘變處理后，共挑得單菌落200個，不同ARTP誘變時間的致死率和正突變率如表1所示，隨著誘變時間延長，菌株的致死率明顯增加，正突變率先隨著致死率的增加而增加，誘變40 s后致死率增加正突變率減少，選擇ARTP最佳誘變時間為30 s，此時致死率為70.3%，正突變率最高31.7%，有利于篩選高產(chǎn)菌株。

表1 不同ARTP誘變時間菌種的致死率與正突變率Tab 1 Fatality rate and positive mutation rate of different ARTP mutagenesis time strains

3.1.2 UV誘變的作用結(jié)果 原始菌株經(jīng)UV誘變處理后，共挑得單菌落200個，如表2所示菌株孢子的致死率隨著UV誘變的時間增加而增加，紫外誘變150 s時，致死率為90.6%，正突變率最高為33.5%。由于致死率過高，還要進行復合誘變，所以確定UV最佳誘變時間為120 s，致死率為75.9%，正突變率為29.3%。

表2 不同UV誘變時間菌種的致死率與正突變率Tab 2 Fatality rate and positive mutation rate of different UV mutagenesis time strains

3.1.3 ARTP+UV復合誘變的作用結(jié)果 原始菌株經(jīng)復合誘變處理后，共挑得單菌落200個，如表3所示孢子懸液經(jīng)ARTP30 s+UV60 s誘變后，菌株致死率為97.4%，正突變率為52.8%。篩選出一株高產(chǎn)菌株，搖瓶效價在1085 μg/mL，比出發(fā)菌株提高了4倍，其含量測定的液相色譜圖見圖1～圖3。

表3 ARTP和UV復合誘變的致死率和正突變率Tab 3 Mortality and positive mutation rate of ARTP and UV combined mutagenesis

圖1 多拉菌素標準品液相色譜圖Fig 1 Liquid chromatogram of doramectin standard

圖2 原始菌株液相色譜圖Figure 2 Liquid chromatogram of original strain

圖3 高效價菌株液相色譜圖Fig 3 Liquid chromatogram of high titer strain

3.2菌種穩(wěn)定性結(jié)果 對效價為1085 μg/mL的高產(chǎn)菌株連續(xù)進行5次傳代，驗證菌種傳代穩(wěn)定性，結(jié)果如表4所示，傳到四代斜面時，效價有小幅下降，五代斜面有明顯的降低，說明篩選的多拉菌素高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性高。

表4 高產(chǎn)菌株的穩(wěn)定性驗證Tab 4 Stability verification of high-yielding strains

3.3 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

3.3.1 發(fā)酵溫度的確定 在25 ℃、28 ℃、30 ℃培養(yǎng)溫度下分別培養(yǎng)種瓶發(fā)酵瓶，檢測結(jié)果如表5，不同溫度下多拉菌素的產(chǎn)量變化較大，種瓶與發(fā)酵瓶的最適培養(yǎng)溫度均為28 ℃。

表5 不同發(fā)酵溫度對多拉菌素發(fā)酵產(chǎn)量的影響Tab 5 Effect of different fermentation temperature on fermentation yield of doramectin

3.3.2 發(fā)酵搖瓶裝量的影響 由表6所示，發(fā)酵裝量為35 mL時，搖瓶效價最高，裝量40 mL以上時效價明顯降低，所以確定最佳發(fā)酵裝量為35 mL/300 mL。

表6 搖瓶裝量對多拉菌素發(fā)酵產(chǎn)量的影響Tab 6 Influence of shake bottle volume on fermentation yield of doramectin

3.3.3 種齡結(jié)果

分別將培養(yǎng)了16、24、32、40、48 h的種子液按10%的接種量轉(zhuǎn)到發(fā)酵瓶中，28 ℃培養(yǎng)12 d，檢測多拉菌素效價。由下表可知，種瓶培養(yǎng)32 h時檢測效價最高。

表7 種齡對多拉菌素發(fā)酵產(chǎn)量的影響Tab 7 Effect of seed age on fermentation yield of doramectin

3.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)時間對多拉菌素產(chǎn)量的影響 種子液接入發(fā)酵瓶后，發(fā)酵瓶分別培養(yǎng)12、13、14、15 d放瓶檢測多拉菌素的效價，如表8所示，發(fā)酵搖瓶14 d時效價最高，確定發(fā)酵時間為14 d。

表8 發(fā)酵培養(yǎng)時間對多拉菌素產(chǎn)量的影響Tab 8 The influence of fermentation time on the production of doramectin

4 討論與結(jié)論

實驗室保藏的菌株由于生產(chǎn)能力低，不具備工業(yè)化生產(chǎn)的條件[9]，誘變技術(shù)可以實現(xiàn)短時間內(nèi)篩選出高產(chǎn)菌株，目前生產(chǎn)所用菌種多為誘變菌種，為企業(yè)節(jié)約了成本和時間。其中復合誘變技術(shù)的利用，可以獲取較多的突變菌株。朱晥宜[10]等UV、SP 等的復合誘變，有效地改變菌種對誘變劑的敏感度，獲得的高產(chǎn)突變株其生產(chǎn)能力比出發(fā)株提高了127%。吳婕[11]對孢子懸液進行紫外誘變、DES誘變和紫外-DES復合誘變、NTG誘變均表現(xiàn)出較好效果。本實驗以RDL19-1為出發(fā)菌株，通過ARTP-UV復合誘變，獲得一株高產(chǎn)菌，搖瓶效價可達1085 μg/mL，比出發(fā)菌株提高了4倍，連續(xù)傳代5次遺傳性狀穩(wěn)定。同時對獲得的多拉菌素高產(chǎn)菌株發(fā)酵進行條件優(yōu)化，考察了發(fā)酵溫度、搖瓶裝量、種齡、發(fā)酵培養(yǎng)時間等方面的影響，結(jié)果表明：種瓶在28 ℃培養(yǎng)32 h，以10%的接種量轉(zhuǎn)入裝量為35 mL/300 mL 發(fā)酵瓶中，在28 ℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)14 d，多拉菌素發(fā)酵產(chǎn)量最高，平均最高效價可達1390 μg/mL。

多拉菌素是阿維鏈霉菌突變株在發(fā)酵過程中添加環(huán)己烷羧酸得到的產(chǎn)物，在發(fā)酵過程中前體物質(zhì)含量過多過少都會影響代謝活動，造成多拉菌素發(fā)酵產(chǎn)量低，適量的前體物質(zhì)可以提高菌種代謝活動，縮短合成周期，提高發(fā)酵產(chǎn)量。楊世紅[3]等考察了不同前體對多拉菌素生物合成的作用，以及有效前體的最佳添加濃度和添加時間，丙酸鈉是多拉菌素合成的最佳前體，在發(fā)酵96 h時添加0.1%的丙酸納，多拉菌素產(chǎn)量達139.89 μg/mL，比對照組提高了38.2%，前體物質(zhì)對多拉菌素的生物合成影響顯著。刁金娜[1]通過對前體添加時間和濃度的研究，在發(fā)酵第一天和第六天分別添加0．1%和0.06%前體環(huán)己烷甲酸鈉能促進多拉菌素產(chǎn)素。在接下來的研究中，通過對前體物質(zhì)添加濃度和添加時間的控制，以期提高多拉菌素的發(fā)酵產(chǎn)量。