汪 悅，楊 陽，胡小艷，匡 敏，余 薇，鄔穎華

（1.四川省成都市第一人民醫(yī)院/成都市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院影像科，四川 成都 610075；2.成都中藥大學(xué)，四川 成都 610075；3.四川省成都市第二人民醫(yī)院影像科，四川 成都 610075）

中醫(yī)藥治療糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）在改善患者臨床癥狀、延緩腎衰竭方面有獨特優(yōu)勢。中藥復(fù)方糖腎方補(bǔ)氣益陰、活血去瘀，能糾正2 型DN 氣陰兩虛夾瘀證患者的多個代謝途徑、減少尿蛋白、改善早期DN 患者的臨床癥狀［1-4］。但目前評價糖腎方療效的手段還局限于尿蛋白和腎臟病理活檢。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，微量白蛋白尿患者的腎臟大多已發(fā)生晚期DN 病理學(xué)改變［5］，即尿蛋白可能并不是早期DN 的敏感指標(biāo)。腎臟活檢雖是評價腎臟病理結(jié)構(gòu)損傷的金標(biāo)準(zhǔn)，但其有創(chuàng)性難以讓患者廣泛接受。血氧水平依賴成像（blood oxygenation level dependent，BOLD）與DTI 是新興的評價腎臟功能的影像學(xué)方法，具有非侵入性、無輻射、無需注射對比劑等特點。本研究應(yīng)用BOLD 和DTI，對腎功能進(jìn)行影像學(xué)評價，進(jìn)而評價糖腎方的療效，為中醫(yī)藥的治療效果評估提供新的實驗依據(jù)，同時也拓寬了fMRI 的應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與藥物 35 只SPF 級SD 雄性大鼠，體質(zhì)量180～200 g，購于成都達(dá)碩實驗動物有限公司，實驗單位使用許可證編號SYXK（川）2015-030。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，選取5 只作為空白組，予以普通飼料喂養(yǎng)10 周，一次性注射等體積的檸檬酸鈉緩沖液。余30 只大鼠予以高糖高脂飼料，飼養(yǎng)10 周后，腹腔注射1%鏈脲佐菌素（STZ）溶液（劑量40 mg/kg體質(zhì)量），誘導(dǎo)糖尿病模型。72 h 后至少連續(xù)3 次空腹血糖值≥16.7 mmol/L，即視為糖尿病模型造模成功［6］；再持續(xù)監(jiān)測模型大鼠空腹血糖2 周，高血糖（≥16.7 mmol/L）狀態(tài)穩(wěn)定者納入實驗。造模成功的24 只大鼠隨機(jī)分為糖腎方組、模型組各12 只，最終糖腎方組存活9 只、模型組8 只。

1.2 實驗室檢查與病理學(xué)檢查 糖腎方組采用糖腎方煎劑灌胃，劑量3.6 g/kg 體質(zhì)量。糖腎方煎劑由黃芪30 g、鬼箭羽15 g、地黃12 g、枳殼12 g、山茱萸9 g、大黃6 g、三七3 g 組成，煎制成含生藥0.36 g/mL 的藥液，4 ℃保存?？瞻捉M和模型組均采用等體積的蒸餾水灌胃，連續(xù)干預(yù)6 周。

每周末，大鼠禁食不禁水12 h，測量其體質(zhì)量，并用血糖儀取尾尖靜脈血測空腹血糖。在中藥治療第0、2、4 周末分別將大鼠放入代謝籠，禁食不禁水，收集其24 h 尿液，記錄尿量并測定24 h 尿蛋白水平。MRI 掃描完成后，處死大鼠，取右腎，去除包膜，用4%多聚甲醛固定，隨后送檢行常規(guī)HE 染色和PAS 染色病理檢查。結(jié)合實驗室檢查與病理檢查，根據(jù)國際公認(rèn)的DN 的Mogensen 分期標(biāo)準(zhǔn)［7］進(jìn)行病理分期。

1.3 MRI 檢查 采用GE 3.0 T MRI 掃描儀，動物線圈。腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，用膠帶和紗布固定，以腎臟為中心，對3 組大鼠分別行常規(guī)MRI T2WI、BOLD、DTI 掃描，掃描參數(shù)見表1。

表1 MRI 掃描參數(shù)

圖像傳送至后處理工作站，由2 位經(jīng)培訓(xùn)的研究生進(jìn)行盲法閱片。分別在自動擬合生成的T2*灰階圖像和b=0 s/mm2的DTI 圖像上，于腎門水平選擇無變形、無偽影的層面劃定ROI，左右腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)分別勾畫3 個橢圓形ROI，大小盡量一致，每個ROI≥5 個像素，測得雙腎皮質(zhì)、髓質(zhì)的橫向弛豫率（R2*）值、ADC 值與各向異性分?jǐn)?shù)（fractional anisotropy，F(xiàn)A）值，最后取平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行分析，計量資料以表示。體質(zhì)量、尿量符合正態(tài)分布且方差齊，組間比較行LSD 檢驗；血糖，腎皮髓質(zhì)的R2*值、ADC 值與FA 值不符合正態(tài)分布和/或方差不齊，組間比較行Kruskal-Wallis H 檢驗。腎皮質(zhì)與對應(yīng)的髓質(zhì)R2*值、ADC 值、FA 值不符合正態(tài)分布，組內(nèi)比較行Wilcoxon 符號秩檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況、生化指標(biāo)（表2～5）實驗期間，空白組一般情況良好，生化指標(biāo)正常。干預(yù)第6 周，糖腎方組和模型組大鼠較空白組體質(zhì)量顯著降低（均P＜0.05），空腹血糖顯著升高（均P＜0.05）。糖腎方組較模型組的空腹血糖低（P＜0.05）。第4 周時，模型組與糖腎方組尿量、24 h 尿蛋白均較空白組顯著升高（均P＜0.05）。

表2 3 組大鼠體質(zhì)量變化（g，）

表2 3 組大鼠體質(zhì)量變化（g，）

注：與空白組同一時間相比，a，P＜0.05；b，P＜0.01。造模前：指飲食干預(yù)10 周后，注射1%鏈脲佐菌素溶液前。

2.2 MRI 掃描

2.2.1 常規(guī)MRI 表現(xiàn) 3 組大鼠腎臟的R2*偽彩圖、ADC 偽彩圖、FA 圖均觀察到腎皮質(zhì)、髓質(zhì)分界清楚。R2*偽彩圖、FA 圖示腎皮質(zhì)呈藍(lán)色，髓質(zhì)呈綠色；ADC偽彩圖示腎皮質(zhì)呈綠色，髓質(zhì)呈藍(lán)色，但3 組間各MRI 圖像無明顯的肉眼差異（圖1）。

2.2.2 3 組BOLD 檢查中R2*值比較（表6）模型組與糖腎方組的皮質(zhì)、髓質(zhì)R2*值均高于空白組；其中模型組髓質(zhì)R2*值與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；3 組髓質(zhì)R2*值與皮質(zhì)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.2.3 3 組DTI 檢查中ADC 值與FA 值比較（表7）模型組的腎皮質(zhì)ADC 值較空白組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而其髓質(zhì)FA 值稍低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。糖腎方組較模型組的腎皮質(zhì)ADC 值有降低趨勢，且髓質(zhì)FA 值有升高趨勢，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

組內(nèi)比較，3 組髓質(zhì)FA 值均高于皮質(zhì)（均P＜0.05）。模型組的腎皮質(zhì)ADC 值高于髓質(zhì)（P＜0.05）。

表3 3 組大鼠尿量變化（mL，）

表3 3 組大鼠尿量變化（mL，）

注：與空白組同一時間相比，a，P＜0.01；b，P＜0.05。

表4 3 組大鼠空腹血糖變化（mmol/L，）

表4 3 組大鼠空腹血糖變化（mmol/L，）

注：與空白組同一時間相比，a，P＜0.01，b，P＜0.05。與模型組同一時間相比，c，P＜0.05。

表5 3 組大鼠24 h 尿蛋白定量變化（mg/24 h，）

表5 3 組大鼠24 h 尿蛋白定量變化（mg/24 h，）

注：與空白組同一時間相比，a，P＜0.01。

表6 3 組大鼠腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)R2*值比較（）

表6 3 組大鼠腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)R2*值比較（）

注：R2*值，橫向弛豫率。與模型組相比，a，P＜0.05。

表7 3 組大鼠腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)ADC 值與FA 值比較（）

表7 3 組大鼠腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)ADC 值與FA 值比較（）

注：FA，各向異性分?jǐn)?shù)。與空白組相比，a，P＜0.01；與同組皮質(zhì)ADC 值相比，b，P＜0.05；與同組皮質(zhì)FA 值相比，c，P＜0.05。

2.3 3 組腎臟病理檢查 空白組右腎標(biāo)本均無病理性損傷；模型組與糖腎方組腎小管上皮細(xì)胞腫脹，甚至壞死、管腔擴(kuò)張、腎小管間質(zhì)結(jié)締組織輕度增生，腎小球基底膜輕度增厚，PAS 陽性物質(zhì)增多，腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤等不同程度的病理損傷。根據(jù)Mogensen 分期標(biāo)準(zhǔn)，模型組8 只大鼠中6 只為DNⅡ期（75.0%），2 只為Ⅰ期（25.0%）；糖腎方組9 只大鼠中5 只為Ⅱ期（55.6%），4 只為Ⅰ期（44.4%），即模型組與糖腎方組大鼠腎臟均處于早期DN 病理改變（圖1）。

圖1 空白組、模型組、糖腎方組的橫向弛豫率（R2*）偽彩圖、ADC 偽彩圖、各向異性分?jǐn)?shù)（FA）圖、HE 染色圖（200 倍）、PAS 染色圖（200 倍）。3 組大鼠腎臟的R2*偽彩圖、ADC 偽彩圖、FA 圖均觀察到腎皮質(zhì)、髓質(zhì)分界清楚。R2*偽彩圖、FA 圖顯示腎皮質(zhì)為藍(lán)色，髓質(zhì)綠色；ADC 偽彩圖顯示腎皮質(zhì)呈綠色，髓質(zhì)呈藍(lán)色，但3 組間各MRI 圖像無明顯的肉眼差異?？瞻捉MHE 染色圖顯示腎小球形態(tài)正常，腎小管緊密排列，未見異常。模型組HE 染色圖中腎小管上皮細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)疏松（黑箭）；少量腎小管上皮細(xì)胞壞死，胞核固縮深染或碎裂溶解（紅箭）；間質(zhì)少量結(jié)締組織增生（黃箭）；并伴少量炎性細(xì)胞浸潤（綠箭）；腎小管管型（藍(lán)箭）；少量腎小管管腔內(nèi)可見壞死細(xì)胞碎片（橙箭）。糖腎方組HE 染色圖中腎小動脈周圍可見大量炎性細(xì)胞灶性浸潤（黑箭）?？瞻捉MPAS 染色圖中腎小球結(jié)構(gòu)正常，毛細(xì)血管叢結(jié)構(gòu)清晰，PAS 陽性未見明顯增多，基底膜與系膜基質(zhì)未見明顯增多。模型組、糖腎方組PAS 染色圖中偶見腎小球PAS 陽性物質(zhì)增多，基底膜輕微增厚

3 討論

3.1 BOLD 技術(shù)評估糖腎方治療早期DN 療效的可行性 多種慢性腎臟疾病的腎臟都具有缺氧表現(xiàn)［8］。BOLD 利用脫氧血紅蛋白的順磁性，通過R2*值反映脫氧血紅蛋白的濃度變化。R2*值越高，脫氧血紅蛋白的濃度越大，周圍組織的氧氣分壓降低［9］，組織越缺氧。本研究顯示，模型組的髓質(zhì)R2*值高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），這與匡敏等［10］的實驗結(jié)果一致，表明BOLD 可評價早期DN 大鼠腎的氧合水平。經(jīng)糖腎方治療后，糖腎方組的腎髓質(zhì)R2*值較模型組有下降趨勢，表明糖腎方能改善早期DN腎臟缺氧，這與糖腎方組成藥物的現(xiàn)代藥理學(xué)研究相符［11-15］，進(jìn)一步證實BOLD 評價糖腎方治療早期DN 的療效具有一定的可行性。

3.2 DTI 技術(shù)評估糖腎方治療早期DN 療效的可行性 ADC 值表示水分子彌散的自由性，F(xiàn)A 值表示水分子擴(kuò)散的各向異性變化。ADC 值越高，表明水分子擴(kuò)散越自由，反之則越受限；FA 值越高，表明水分子的各向異性越高，反之則越低。腎臟血液灌注高、水液代謝旺盛且高度結(jié)構(gòu)化，使得DTI 成為研究腎臟相關(guān)疾病的理想手段之一。

本研究中，空白組大鼠腎臟的皮質(zhì)FA 值低于髓質(zhì)值（P＜0.05），與胡小艷等［16-17］的研究結(jié)果相符，證實正常腎髓質(zhì)的FA 值高于皮質(zhì)，這是因為腎髓質(zhì)有規(guī)律排列形成輻射狀的髓襻、集合管和微小血管，各向異性較高，而皮質(zhì)由雜亂的血管球構(gòu)成，F(xiàn)A 值較低，故髓質(zhì)的FA 值大于皮質(zhì)。病理檢查結(jié)果顯示，模型組腎臟處于DNⅠ、Ⅱ期，發(fā)生了腎小管擴(kuò)張、小管上皮細(xì)胞水腫，甚至壞死、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤增生等微觀變化，從而抑制水分子運動的FA 值［18-19］。與模型組相比，糖腎方組經(jīng)糖腎方治療腎髓質(zhì)FA 值有上升趨勢，提示糖腎方可延緩腎臟病理結(jié)構(gòu)損傷，進(jìn)而證明DTI 可評價糖腎方在延緩腎臟病理損傷方面的療效。

本研究顯示，模型組較空白組的皮質(zhì)ADC 值升高（P＜0.01），表明早期DN 腎皮質(zhì)所含自由水的彌散運動加劇。由于早期DN 腎皮質(zhì)的血流量較大，形成超濾過狀態(tài)，經(jīng)腎小球濾過的原尿增多，腎皮質(zhì)的灌注量也增多，故水分子的運動更自由，表現(xiàn)為ADC值增大［16］。糖腎方組較模型組皮質(zhì)ADC 值有降低趨勢，提示糖腎方可緩解早期DN 腎臟的高濾過狀態(tài)。

綜上所述，糖腎方治療早期DN 有一定療效，可能在改善早期DN 腎臟的缺氧狀態(tài)和微觀病理結(jié)構(gòu)改變方面有一定作用。BOLD 和DTI 可通過評估早期DN 腎臟功能進(jìn)而評價糖腎方的療效，且早于尿蛋白及腎臟病理學(xué)檢查，但仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。