陳丹丹，董 博，歐國峰，王國柱，肖 斌，陳 瑞，袁普衛(wèi)，方 晴

1 陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2 陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；3 陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院

骨質(zhì)疏松癥是一種全身性代謝性疾病，主要表現(xiàn)為骨量低下或骨微觀結(jié)構(gòu)改變，進而引起骨脆性和骨折風(fēng)險增加［1］。據(jù)不完全統(tǒng)計，目前世界上原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者已超過2 億，世界衛(wèi)生組織將其列為老年人三大疾病之一［2］。本病屬祖國醫(yī)學(xué)“骨痿”“骨痹”等范疇，雖然其病因和發(fā)病機制尚未完全闡明，但中醫(yī)藥治療具有明顯優(yōu)勢［3-5］?？故鑿姽穷w粒是陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，在治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥方面取得了良好效果［6］。本研究旨在觀察抗疏強骨顆粒對去卵巢模型大鼠血清堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和人抗酒石酸酸性磷酸酶5b（tartrate resistant acid phosphatase 5b，TRACP5b）的影響，探討其作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選用6 月齡清潔級未懷孕雌性大鼠100 只，體質(zhì)量約（200±50）g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供，檢疫符合實驗研究標(biāo)準(zhǔn)，生產(chǎn)許可證號：SCXK（陜）2017-003。

1.2 實驗藥物抗疏強骨顆粒由陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中草藥房提供，藥物組成：黃芪30 g，熟地黃15 g，淫羊藿15 g，肉蓯蓉15 g，菟絲子15 g，當(dāng)歸12 g，丹參12 g，三七6 g，延胡索15 g，白芍12 g，骨碎補15 g，牛膝15 g，甘草10 g，1 g干浸中藥粉末相當(dāng)于2.83 g生藥。

1.3 實驗主要試劑與儀器ALP 試劑盒（批號：

AR0019）、TRACP5b 試劑盒（批號：ST1021）均由陜西博達生物科技有限公司提供；蘇木素染液（批號：ST047）；伊紅染液（批號：G1120）均由北京索萊寶科技有限公司提供；固定板、手術(shù)器械、離心管、移液槍、EP 管等；2135 型石蠟切片機（德國萊卡）；DM400B生物顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.4 方法

1.4.1 造模方法 除正常組外，其他組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后開始造模，造模前將大鼠禁食、禁水24 h，10%水合氯醛（0.15 mL/100 g）腹腔內(nèi)注射麻醉，待大鼠進入睡眠狀態(tài)（麻醉滿意）后俯臥固定，剔除腰脊背部兩側(cè)毛發(fā)，用濕紗布擦拭，手術(shù)部位擦干凈后進行局部消毒，沿腰椎左側(cè)切開1 cm 皮膚，取出筋膜，分離肌肉后可見腎臟外下方呈淡粉色的卵巢及緊密相連的子宮角，在子宮上端及下部輸卵管部位結(jié)扎［7］，切斷子宮角，摘除卵巢并稱重，用同樣的方法切除右側(cè)卵巢，清洗后依次逐層關(guān)閉切口，齒鑷對皮后縫合皮膚，傷口涂抹紅霉素并用消毒紗布包扎。術(shù)后臀肌注射青霉素（40 萬IU/kg）7天，每天1次，預(yù)防感染。該“切除雙側(cè)卵巢”造模方法于1969年由Saville最先建立，經(jīng)過長期反復(fù)實驗驗證，具有可靠性，國內(nèi)外應(yīng)用廣泛［8］。飼養(yǎng)90 天后造模組大鼠出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、精神不振等癥狀，骨組織病理切片示出現(xiàn)骨質(zhì)疏松病理改變，提示造模成功。

1.4.2 分組及給藥 根據(jù)隨機數(shù)字表法將造模后的大鼠分為模型組和中藥（大、中、小劑量）組，另設(shè)未造模正常組，每組20 只分籠飼養(yǎng)，予抗生素常規(guī)喂養(yǎng)7日后開始給藥，中藥大、中、小劑量組按照相應(yīng)劑量灌胃給藥（2.865、1.432、0.714 mg/kg）抗疏強骨顆粒，均分別制成2 mL 溶液灌胃），每日1 次，每周6 次，連續(xù)給藥3 個月，正常組和模型組正常飼養(yǎng)不給藥。為計量準(zhǔn)確，灌胃期間，每2 周用電子天枰稱體質(zhì)量1次。

1.4.3 標(biāo)本采集 正常組正常飼養(yǎng)2 周、模型組于造模成功后處死取材。其余各組在完成3 個月灌胃給藥后，10%水合氯醛（0.15 mL/100 g）腹腔內(nèi)注射麻醉（取材前1 天需禁食24 h），待麻醉滿意后腹部備皮消毒。1）取血：沿腹部中線切開至腹腔，拔開腸管在腹腔后壁可見腹主動脈，用采血針穿刺腹主動脈將血標(biāo)本采集在負壓采血管中3 mL，拔除采血管。將血液離心后取上清液，離心半徑10 cm，3000 r/min，離心20 min，放入無菌EP 管置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?）骨組織切片取材：取大鼠右側(cè)股骨去除肌肉和筋膜，保留骨膜部分，取出股骨遠端，置于10%福爾馬林溶液中固定24 h，然后置于10%脫鈣液中，脫鈣液每天更新，直到可以用大頭針輕輕刺入，大約用時3周。

1.4.4 觀察指標(biāo) 觀察正常組、模型組和中藥（大、中、小劑量）組給藥前后大鼠一般情況（包括體質(zhì)量、精神狀態(tài)、毛發(fā)顏色和光澤等）；使用ElISA 方法檢測大鼠血清ALP 和TRACP5b，繪制相關(guān)曲線以確定其含量；將脫鈣后的股骨標(biāo)本常規(guī)包埋并用HE 染色觀察鏡下骨小梁結(jié)構(gòu)及骨細胞和骨髓脂肪細胞的形態(tài)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以表示，采用單因素方差分析，組間多重比較方差齊用LSD-t檢驗，方差不齊用Tambane's T2 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況正常組大鼠除體質(zhì)量增加外，其他（精神狀況、毛發(fā)顏色和光澤等）無明顯異常；手術(shù)當(dāng)天，所有造模大鼠精神較差，活動較少，術(shù)后第4 天精神狀態(tài)和活動基本恢復(fù)正常，能夠正常飲水和進食。造模組大鼠造模90 天后精神狀況較差，毛發(fā)顏色晦暗無光澤，體質(zhì)量下降顯著，偶有毛發(fā)脫落等；給予相應(yīng)劑量藥物灌胃后大鼠精神狀況尚可，毛發(fā)色澤較正常組稍差，體質(zhì)量輕微下降，整體接近正常組大鼠狀態(tài)。

2.2 各組大鼠股骨病理切片正常組大鼠細胞結(jié)構(gòu)清晰，大小、形態(tài)正常；模型組軟骨細胞顯示有空骨陷窩，細胞核聚縮，且排列不整齊，骨小梁內(nèi)骨細胞明顯減少；中藥（大、中、小劑量）組軟骨細胞排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)完整，空骨陷窩罕見，接近正常組。見圖1。

圖1 各組動物骨組織HE染色結(jié)果（×40）

2.3 血清ALP 及TRACP5b 含量與正常組比較，模型組血清ALP及TRACP5b含量上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥大、中、小劑量組血清ALP及TRACP5b含量下降，中劑量組含量最低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠血清ALP及TRACP5b含量（)

表1 各組大鼠血清ALP及TRACP5b含量（)

注：*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與中藥中劑量組比較，P＜0.05

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種全身性骨病，系因各種原因?qū)е鹿橇繙p少或骨微結(jié)構(gòu)改變，最終因骨骼變脆易于發(fā)生骨折［9-10］。有研究［10］表明絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)生與體內(nèi)雌激素分泌水平有密切聯(lián)系，雌激素對骨代謝具有調(diào)節(jié)作用。祖國醫(yī)學(xué)認為人體是一個有機整體，五臟六腑、氣血陰陽之間相互作用和影響，腎主骨，腎精不足則骨髓不滿，故從腎論治各醫(yī)家達到共識［11-13］。肝腎同源，主疏泄，主藏血，兩者之間互相轉(zhuǎn)化，若肝失疏泄，血與精津液生產(chǎn)及運行受到影響，骨不得充，筋骨不堅，引起疼痛［14-15］。陜西省名中醫(yī)劉德玉教授認為骨瘺（骨質(zhì)疏松癥）是因人素體虛弱，臟腑虛衰，耗損正氣，以致肝腎虧虛為本，正氣不足，無力生血行血，血行不暢，筋骨經(jīng)脈不得濡養(yǎng)，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松性骨折，肝腎不足是基礎(chǔ)，以補益肝腎為治療大法?！翱故鑿姽穷w?！币渣S芪、熟地黃為君，益氣助陽、補肝益腎；仙靈脾、肉蓯蓉、菟絲子補腎健脾，強筋健骨；當(dāng)歸、丹參、三七活血化瘀補血；延胡索、白芍活血止痛；骨碎補、牛膝補肝腎強筋骨；甘草益氣止痛，調(diào)和諸藥。組方立法嚴謹，既不忘補肝腎強筋骨，同時兼活血化瘀止痛，標(biāo)本兼治，正中病因病機。

TRACP5b 是破骨細胞分泌的糖基化蛋白酶，是人體骨吸收的敏感指標(biāo)。人體血清中存在TRACPa、TRACPb 兩種類型，且二者含量相近，來源不同，在唾液酶作用下二者可相互轉(zhuǎn)化。來源于巨噬細胞的TRACPa 無酶活性，破骨細胞分泌的TRACPb 具有酶活性，且不受肝腎代謝影響，晝夜數(shù)值較穩(wěn)定，具有廣泛的應(yīng)用性。SALMINEN 等［16］通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)TRACPb 是一個敏感度高、可靠性強的骨吸收檢測指標(biāo)。向青等［17］對大量正常及骨質(zhì)疏松患者臨床研究發(fā)現(xiàn)其血清TRACPb水平不同程度升高，證實TRACPb 是一個較好的骨吸收指標(biāo)，可在一定程度上代替骨密度儀作為反映骨丟失速率的重要指標(biāo)。堿性磷酸酶ALP 是反應(yīng)骨轉(zhuǎn)換的常用指標(biāo)，其在人體中分布廣泛，血清ALP 主要來源于骨組織與肝臟。相關(guān)研究［18-20］表明堿性磷酸酶與骨礦物質(zhì)化密切相關(guān)，堿性磷酸酶水平可反映成骨細胞活性，是目前評估人體骨礦化障礙的最佳指標(biāo)。本實驗選取大鼠作為實驗動物，具有價格低廉，喂養(yǎng)方便，與人體解剖結(jié)構(gòu)相似，更易建立骨代謝與吸收平衡等一系列優(yōu)點，采用切除大鼠雙側(cè)卵巢這一經(jīng)典造模方法，模擬人絕經(jīng)后雌激素下降狀態(tài)，采用HE 染色觀察造模成功與否以及其骨組織病理學(xué)改變，通過TRACP5b、ALP水平檢測骨代謝情況，進一步探討中藥抗疏強骨顆粒治療作用與TRACP5b、ALP的相關(guān)性，為骨質(zhì)疏松的中醫(yī)藥防治提供一定的實驗基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果表明，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠血清TRACP5b、ALP 上升，其原因可能與骨質(zhì)疏松的病因有關(guān)，抗疏強骨顆粒能降低去卵巢模型大鼠血清TRACP5b、ALP 含量，其中中劑量效果最顯著。由此得知抗疏強骨顆粒通過降低去卵巢模型大鼠血清ALP、TRACP5b 水平，降低破骨細胞活性，抑制骨吸收，從而治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。