馮思穎，吳威妮，褚慶民，邱藝俊，李思寧△

1 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510000；2 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是各種心臟疾病的嚴(yán)重階段或晚期階段，由心臟結(jié)構(gòu)改變或功能失常導(dǎo)致，常見癥狀有活動耐量下降、呼吸困難、咳嗽咳痰、難以平臥、雙下肢水腫等。CHF 是臨床常見的危急重癥，根據(jù)心臟收縮/舒張功能障礙，可分為收縮性心力衰竭與舒張性心力衰竭，根據(jù)其不同臨床表現(xiàn)，可分為左心力衰竭、右心力衰竭、全心力衰竭［1］。目前患有CHF 的人數(shù)處于上升階段，且與年齡相關(guān)，患病率隨年齡增長而增加［2］。有研究［3］表明，55 歲人群中30%的人會發(fā)生心力衰竭，其5 年生存率為35%，住院后1 年死亡率為25%。目前對于CHF 的治療，主要控制基礎(chǔ)病，口服β-受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑/血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑、醛固酮拮抗劑等［1］，可有效控制心衰發(fā)展，但仍存在不良反應(yīng)多、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重的缺點(diǎn)。因此，發(fā)揮中藥簡、驗(yàn)、廉、便的作用顯得尤為重要。

根據(jù)癥狀特點(diǎn)，可將CHF 歸于中醫(yī)“心衰病”“喘證”“心悸”“水腫”范疇。葶藶大棗瀉肺湯出自《金匱要略》，可瀉肺行水，下氣平喘，是治療CHF的常用方，越來越多的研究證實(shí)其療效可靠［4-5］。但其作用機(jī)制尚不明確。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，可將藥物作用從分子、細(xì)胞到組織和有機(jī)體水平揭示藥物-基因-靶點(diǎn)-疾病之間的交互網(wǎng)絡(luò)關(guān)系［6］。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論，預(yù)測葶藶大棗瀉肺湯治療CHF 的機(jī)制，以期為臨床實(shí)踐提供一定理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 葶藶子、大棗活性成分獲取中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP）是一個大型數(shù)據(jù)整合平臺，既可對多種中藥進(jìn)行活性成分分析及靶點(diǎn)獲取，還可建立藥物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及藥物-疾病網(wǎng)絡(luò)，有助于揭示中草藥的作用機(jī)制及中醫(yī)理論本質(zhì)［7］。在TCMSP 平臺（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）分別以“葶藶子”“大棗”為檢索詞檢索，獲得其化學(xué)成分，限定其口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug likeness，DL）≥0.18，篩選出其活性成分。并通過Pubchem平臺（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索出每一個活性成分的Canonical SMILES碼。

1.2 活性成分作用靶點(diǎn)獲取Swissarget Prediction 是一個用于生物活性小分子靶預(yù)測的網(wǎng)絡(luò)平臺，預(yù)測可在5 種生物中進(jìn)行，可輸入活性成分SMILES 進(jìn)行檢索［8］。將活性成分的Canonical SMILES 碼輸入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetpre-diction.ch/），限定物種為“Homo sapiens”，篩選出每個活性成分的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白名稱、基因名稱等信息。

1.3 CHF 相關(guān)靶點(diǎn)獲取以“chronic heart failure”為檢索詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）中搜索CHF的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 藥物-疾病交集靶點(diǎn)獲取將葶藶子、大棗相關(guān)靶點(diǎn)信息及CHF 相關(guān)靶點(diǎn)信息導(dǎo)入FUNRICH軟件，獲得的交集靶點(diǎn)即為葶藶子、大棗作用于CHF的預(yù)測靶點(diǎn)，并制作Venn圖。

1.5 構(gòu)建中藥活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)使用Cytoscape 3.7.1 軟件對中藥活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，體現(xiàn)中藥活性成分與藥物-疾病共同靶點(diǎn)之間的相互聯(lián)系，且根據(jù)化合物與靶點(diǎn)連接情況篩選出中藥作用于CHF的關(guān)鍵化合物。

1.6 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選STRING數(shù)據(jù)庫可用于分析生物的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)［9］，將獲得的藥物與疾病共同靶點(diǎn)信息輸入STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），選擇研究物種為“Homo sapiens”，最低相互作用評分設(shè)定為隨機(jī)等置信度，數(shù)值為“confidence（0.990）”，并選擇隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開連接的節(jié)點(diǎn)，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，得到葶藶子、大棗作用于CHF的PPI（靶蛋白相互作用）網(wǎng)絡(luò)。并通過Degree 值篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.7 GO 功能分析和KEGG 通路富集分析將藥物-疾病交集基因?qū)隓AVID 6.8數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp），輸入靶基因名稱列表，設(shè)定其物種為“Homo sapiens”，進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）分類富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 葶藶子、大棗活性成分分析葶藶大棗瀉肺湯由葶藶子和大棗2味中藥組成，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為篩選條件，共獲得活性成分42 個，對其進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中11 個活性成分沒有靶點(diǎn)或無法搜索到其靶點(diǎn)。其余31 個活性成分包括谷固醇、山柰酚、細(xì)胞毒素、光千金藤堿、繡線菊堿A、香豆雌酚等。取其OB值前5位列出，見表1。

表1 葶藶大棗瀉肺湯中OB值前5位活性成分

2.2 活性成分潛在靶點(diǎn)預(yù)測將31 個活性成分Canonical SMILES 碼輸入SwissTarget Prediction，刪除重復(fù)項(xiàng)，得到556個預(yù)測藥物靶點(diǎn)。

2.3 CHF 靶點(diǎn)從Gene Cards 數(shù)據(jù)庫檢索到8232個疾病靶點(diǎn)。

2.4 藥物-疾病交集靶點(diǎn)將556 個化合物靶點(diǎn)與8232 個CHF 相關(guān)靶點(diǎn)基因進(jìn)行映射，得到498個共同靶點(diǎn)基因。

2.5 構(gòu)建中藥活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)將共同靶點(diǎn)基因及葶藶大棗瀉肺湯有效活性成分利用Cytoscape 3.7.1 軟件進(jìn)行中藥活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析，得出與共同靶點(diǎn)有聯(lián)系的活性成分共23個，其中葶藶子8個，大棗13個，葶藶子、大棗共有活性成分2 個（quercetin、beta-sitosterol）。網(wǎng)絡(luò)中有521個節(jié)點(diǎn)（其中中藥活性成分節(jié)點(diǎn)23個，靶基因節(jié)點(diǎn)498個）和2834條邊，由于圖中包含節(jié)點(diǎn)及邊數(shù)較多，難以完整直觀體現(xiàn)，現(xiàn)選葶藶子及大棗共同化合物成分且Degree值位于第二的化學(xué)物進(jìn)行中藥活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)展示（quercetin）。Degree 值較高的前5 位化合物中，最高為富馬堿（Fumarine），其次為槲皮素（quercetin），山柰酚（kaempferol），二荷亞麻酸（Dihomo linolenic acid）和穆坪馬兜鈴酰胺（Moupinamide），這些活性成分可能是葶藶大棗瀉肺湯發(fā)揮治療CHF 的關(guān)鍵，見表2、圖1。

表2 葶藶大棗瀉肺湯關(guān)鍵活性成分基本信息

圖1 中藥活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（quercetin）

2.6 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選將映射得到的498 個交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，基于confidence（0.990），網(wǎng)絡(luò)中發(fā)生蛋白相互作用的靶點(diǎn)有132個，177條邊代表了蛋白間的相互作用。將得出的PPI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件進(jìn)行分析，根據(jù)Degree 值大小，推測葶藶子、大棗治療冠心病與CKD1、AKT1、CCNB1、STAT3、CCNA2、CDC25C、PLK1、CKD2、CCNB2、CDC25A等靶基因關(guān)系較大，見圖2—3。

圖2 葶藶大棗瀉肺湯關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 葶藶大棗瀉肺湯治療慢性心衰靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 GO 功能分析498 個藥物-疾病交集靶點(diǎn)作用了175 個生物學(xué)過程（P＜0.05），選取P值排名前20 的功能信息。結(jié)果顯示，葶藶子、大棗活性成分主要富集在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)磷酸化、對藥物的反應(yīng)、凋亡過程負(fù)調(diào)控、細(xì)胞增殖正調(diào)控、炎癥應(yīng)答、蛋白質(zhì)磷酸化、細(xì)胞增殖、肽基?酪氨酸磷酸化、肽基?絲氨酸磷酸化、ERK1和ERK2級聯(lián)的正調(diào)控、血小板激活、細(xì)胞遷移的正調(diào)控、胞質(zhì)鈣離子濃度的正調(diào)控、配體受體信號通路、白細(xì)胞游走、對乙醇的應(yīng)答、膽堿能突觸傳遞、G 蛋白偶聯(lián)受體信號通路（偶聯(lián)到環(huán)核苷酸第二信使）、血管收縮的正向調(diào)節(jié)等生物活動過程中。結(jié)果顯示，細(xì)胞成分（cellular constituent，CC）分析富集基因數(shù)量較大的有等離子體膜、胞體、質(zhì)膜整體組分、核漿、細(xì)胞膜等；分子功能（molecular function，MF）分析富集基因數(shù)量較大的有蛋白結(jié)合、ATP 結(jié)合、蛋白激酶活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等，見圖4—6。

圖4 葶藶大棗瀉肺湯活性成分潛在靶點(diǎn)GO通路富集分析的BP分析

圖5 葶藶大棗瀉肺湯活性成分潛在靶點(diǎn)GO通路富集分析的CC分析

圖6 葶藶大棗瀉肺湯活性成分潛在靶點(diǎn)GO通路富集分析的MF分析

2.8 KEGG 通路富集分析通路富集分析發(fā)現(xiàn)，該489個靶點(diǎn)主要富集在121條通路上（P＜0.05），其中20 條通路與CHF密切相關(guān)，其中前20 條主要通路包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用、癌癥通路、PI3K/Akt 信號通路、癌癥中的蛋白多糖、cAMP信號通路、黏著斑、鈣離子信號通路、胰島素抵抗、血清能突觸、前列腺癌、甲狀腺激素信號通路、T細(xì)胞受體信號通路、孕酮?介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、HIF-1 信號通路、急性髓樣白血病、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、催乳素信號通路、癌癥的中心碳代謝、非小細(xì)胞肺癌，提示葶藶大棗瀉肺湯可通過多條通路作用于CHF，見圖7。

圖7 葶藶大棗瀉肺湯活性成分潛在靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

3 討論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，應(yīng)用相關(guān)數(shù)據(jù)庫及軟件對葶藶大棗瀉肺湯治療CHF 的作用機(jī)制進(jìn)行探討。葶藶子、大棗共有42 種活性成分，共包括有556 個基因靶點(diǎn)，與CHF 的交集靶點(diǎn)有498個，進(jìn)一步提煉分析出葶藶大棗瀉肺湯治療CHF的生物進(jìn)程、細(xì)胞功能、分子功能，發(fā)現(xiàn)涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)磷酸化、對藥物的反應(yīng)、凋亡過程負(fù)調(diào)控、細(xì)胞增殖正調(diào)控、炎癥應(yīng)答、蛋白質(zhì)磷酸化、細(xì)胞增殖、肽基?酪氨酸磷酸化、肽基?絲氨酸磷酸化、ERK1和ERK2級聯(lián)的正調(diào)控、血小板激活、細(xì)胞遷移的正調(diào)控、胞質(zhì)鈣離子濃度的正調(diào)控、配體受體信號通路、白細(xì)胞游走、對乙醇的應(yīng)答、膽堿能突觸傳遞、G 蛋白偶聯(lián)受體信號通路（偶聯(lián)到環(huán)核苷酸第二信使）、血管收縮的正向調(diào)節(jié)等分子功能，這與CHF的發(fā)生發(fā)展有一定聯(lián)系。

KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)20 條通路與CHF 發(fā)病顯著相關(guān)。葶藶大棗瀉肺湯可能作用于以下通路，從而對CHF的治療發(fā)揮作用。

環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）是普遍存在的第二信使，可維持線粒體穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)線粒體動力學(xué)，并調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和其他信號傳導(dǎo)途徑［10］。其對于心臟，cAMP 是心臟生理學(xué)及病理生理學(xué)的關(guān)鍵調(diào)控因子，其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物是腎上腺素能應(yīng)激時心率、心臟收縮力和舒張力的重要調(diào)控因子之一，持續(xù)的激活cAMP通路，可能會導(dǎo)致心力衰竭進(jìn)展［11］。

PI3K的活化和其下游的AKT是心臟保護(hù)作用重要信號傳導(dǎo)途徑。雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是AKT 的下游靶點(diǎn)，用雷帕霉素抑制mTOR 可預(yù)防心臟肥大，抑制心臟衰竭［12］。在心力衰竭中，AKT 的短期活化可有利于血管的形成、抑制細(xì)胞自噬、調(diào)節(jié)心肌能量代謝、調(diào)節(jié)鈣離子通道、影響心肌炎癥反應(yīng)等，但長期的AKT 活化會導(dǎo)致心肌細(xì)胞功能損傷，因此，維持AKT的平衡尤為重要［13］。

胰島素抵抗和心臟胰島素代謝信號傳導(dǎo)的相關(guān)減少正在成為心力衰竭發(fā)展的主要因素，導(dǎo)致心臟胰島素抵抗發(fā)展的主要因素是氧化應(yīng)激，高血糖，高脂血癥，脂肪因子/細(xì)胞因子分泌失調(diào)和腎素-血管緊張素Ⅱ-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）及交感神經(jīng)系統(tǒng)的不適當(dāng)激活［14］。PI3K/Akt 通路被認(rèn)為在胰島素效應(yīng)中起重要作用［15］。在胰島素抵抗和2 型糖尿病患者中，由于線粒體功能障礙導(dǎo)致的線粒體氧化磷酸化減少，抑制胰島素誘導(dǎo)PI3K 活性，并導(dǎo)致胰島素刺激后AKT2 活性降低，從而對心肌細(xì)胞產(chǎn)生不利影響［16］。

心肌細(xì)胞重塑和轉(zhuǎn)換的途徑，重點(diǎn)是Ca2+信號傳導(dǎo)、自噬和細(xì)胞凋亡。Ca2+處理，通過自噬進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)循環(huán)，以及通過細(xì)胞凋亡進(jìn)行程序性細(xì)胞死亡，這些都是正常心臟功能所必需的［17］。Ca2+信號傳導(dǎo)在心肌細(xì)胞中受到高度調(diào)節(jié)，并決定了心肌收縮的力量。Ca2+循環(huán)是指細(xì)胞內(nèi)Ca2+的釋放和再攝取，可驅(qū)動肌肉收縮和放松。在衰竭的心臟中，Ca2+循環(huán)被徹底改變，導(dǎo)致收縮性受損和致命的心律失常［18］。失敗的心肌細(xì)胞的標(biāo)志是改變的激發(fā)-收縮偶聯(lián)，包括減少的Ca2+瞬變，以及那些瞬變的延遲發(fā)作和衰變。這些變化最終導(dǎo)致心肌收縮力減弱，收縮延遲，放松減緩［17］。

CHF 被認(rèn)為是循環(huán)系統(tǒng)中T 細(xì)胞活化和炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生增加的慢性炎癥狀態(tài)。有研究［19］將CHF 患者和健康對照組T 細(xì)胞和單核細(xì)胞中細(xì)胞因子的基因表達(dá)和表面活性標(biāo)記物的表達(dá)進(jìn)行對照，CHF 患者的T 細(xì)胞表面活化標(biāo)志物CD69 和CD25 表達(dá)增加，認(rèn)為T 細(xì)胞可能是慢性心衰炎癥反應(yīng)的一部分，預(yù)防不必要的T 細(xì)胞活化可能成為治療CHF的新靶點(diǎn)。

甲狀腺激素極大地影響心臟的能量穩(wěn)態(tài)［20］。長期過量甲狀腺激素暴露可能對心臟形態(tài)和功能產(chǎn)生不利影響，因?yàn)槠淇赡茉黾幼笮氖屹|(zhì)量、動脈硬化和左心房大小，并可能誘發(fā)舒張功能障礙，從而影響左心室功能。而甲狀腺功能減退癥的特點(diǎn)是由于心率和腦卒中量的降低而導(dǎo)致的低心排血量。

由于舒張功能受損和血容量減少，心臟預(yù)負(fù)荷降低。雖然耗氧量減少，但其心臟能量效率卻受到損害［21］。HIF-1 是一種轉(zhuǎn)錄因子，在所有動物物種中均作為氧穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)劑［22］。疾病與HIF-1 可相互影響，循環(huán)系統(tǒng)將血液分配到每個組織，并輸送氧氣和營養(yǎng)。血液循環(huán)紊亂會減少氧氣的輸送，從而導(dǎo)致組織缺氧，這種缺氧發(fā)生在多種心血管疾病中，包括動脈粥樣硬化，肺動脈高壓和心力衰竭。盡管可由于心血管疾病而誘發(fā)組織缺氧，但缺氧信號本身具有調(diào)節(jié)組織重塑過程或心血管疾病嚴(yán)重性的能力。HIF-1 在心力衰竭（氧供需不匹配）情況下可被激活，可活化的肌細(xì)胞調(diào)控與氧供應(yīng)、代謝、收縮特性有關(guān)的基因，在負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚的形成和重構(gòu)中發(fā)揮作用［23］。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析及文獻(xiàn)查閱，發(fā)現(xiàn)葶藶大棗瀉肺湯有可能通過多條途徑作用于CHF，且大部分作用通路均與CHF 有密切聯(lián)系，但是由于現(xiàn)代對葶藶子、大棗的研究不多，因此其具體活性成分作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。但可以確定葶藶大棗瀉肺湯可通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療CHF，其具體機(jī)制需要開展相關(guān)研究進(jìn)行驗(yàn)證。