趙 蓓，周夕湲，梁成琳，張麗霞

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院皮膚病性病研究所，四川 成都 610072)

血管瘤屬于良性腫瘤，可發(fā)生于全身各處，女性的發(fā)病率要高于男性。嬰幼兒型血管瘤是小兒最常見的良性腫瘤[1]。然而，傳統(tǒng)治療在臨床應(yīng)用方面的總體療效并不令人滿意，迫切需要更為有效的治療手段和干預(yù)措施。leaute-labreze等在2008年首次報(bào)道嘗試普萘洛爾用于嬰幼兒血管瘤治療后，逐漸引起了各國學(xué)者的關(guān)注[2]，為血管瘤的治療提供了新途徑。目前β-受體阻滯劑在嬰幼兒血管瘤治療中逐漸得到應(yīng)用[3]。然而，β-受體阻滯劑作為替代激素的一線治療藥物，其治療血管瘤的作用機(jī)制、適應(yīng)證及安全性等問題一直是從事血管瘤研究的基礎(chǔ)和臨床工作者們關(guān)注的重點(diǎn)[4，5]。血管瘤中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)較正常組織及消退期血管瘤表達(dá)明顯增高。如果能通過相關(guān)通路驗(yàn)證經(jīng)過β-受體阻滯劑治療后使得VEGF分泌減少，探究到馬來酸噻嗎洛爾作為β-受體阻滯劑的可能作用機(jī)制，則可為血管瘤的臨床用藥和進(jìn)一步機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集四川省人民醫(yī)院病理科2018年6月至2019年6月血管瘤新鮮組織18例，來自手術(shù)切除的血管瘤患者，其中男11例，年齡(36.2±11.2)歲，女7例，年齡(26.5±10.6)歲；患者均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)2019年頒布的《血管瘤和脈管畸形的診斷及治療指南(2019 版)》中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。

1.2 方法

1.2.1瘤體細(xì)胞培養(yǎng) 參考文獻(xiàn)制備腫瘤細(xì)胞懸浮液[7]，使用PBS洗滌新鮮的血管瘤組織樣品并轉(zhuǎn)移到無菌培養(yǎng)皿中。將組織切碎成細(xì)塊狀(1 mm×1 mm)并再次用PBS洗滌。然后將組織用2 mg/ml膠原酶(Invitrogen，CA)消化至少2小時(shí)，在37 ℃下振蕩。通過使用移液管尖端重復(fù)吹打?qū)⒓?xì)胞分散，并通過100 μM尼龍細(xì)胞過濾器過濾。將細(xì)胞以2×105的密度接種在低附著培養(yǎng)皿上使用干細(xì)胞培養(yǎng)(SCC)培養(yǎng)基(Invitrogen，CA)的細(xì)胞/ml，由Knockout DMEM，15%Knockout血清替代物，1×非必需氨基酸(NEAA)和20 ng/ml兩種堿性成纖維細(xì)胞組成。生長因子(bFGF)和人內(nèi)皮生長因子(hEGF)。腫瘤球大約每7天傳代1次(大約200個(gè)細(xì)胞/球)；用PBS洗滌球體1次，然后通過與2 mg/ml膠原酶IV在37 ℃溫育10分鐘制備單細(xì)胞懸浮液。

1.2.2Western blotting 檢測(cè)VEGFR表達(dá)收集血管瘤組織和瘤旁組織，使用PBS進(jìn)行清洗，提取總蛋白進(jìn)行Western blotting實(shí)驗(yàn)。VEGFR抗體購自CST公司(貨號(hào)Cat：#2479)，稀釋比例1∶1000。使用GAPDH為內(nèi)參照，GAPDH一抗購自CST公司(貨號(hào)Cat：#5174)，稀釋比例為1∶5000。

1.2.3定量PCR(Real time-PCR) 檢測(cè)CDC42，MAPK，PI3K基因表達(dá)情況將腫瘤球接種到培養(yǎng)皿上，并在細(xì)胞培養(yǎng)基中暴露于0、2、4 nM馬來酸噻嗎洛爾(參見方法，IH腫瘤球培養(yǎng)物)10天，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。在培養(yǎng)的第5天收集添加0、2 nM馬來酸噻嗎洛爾的腫瘤球細(xì)胞，通過膠原酶IV解離成單個(gè)細(xì)胞并計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)。每個(gè)樣品一式三份進(jìn)行RT-PCR試驗(yàn)。進(jìn)行總RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，之后進(jìn)行定量PCR。體系(總體積10 μl)如下：cDNA1 μl，Primer(50 pM)上下游各0.1 μl，2×PCR MIX (Roche)，ddH2O 3.8 μl。定量PCR退火溫度60 ℃，40個(gè)循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血管瘤組織細(xì)胞培養(yǎng)和VEGFR表達(dá)檢測(cè)VEGFR在血管瘤組織細(xì)胞中表達(dá)明顯高于瘤旁中的表達(dá)(P<0.01)。見圖1。

圖1 VEGFR在血管瘤組織中的表達(dá) a.血管瘤和瘤旁組織VEGFR和GAPDH Western blotting原始電泳條帶圖；b.血管瘤組織VEGFR表達(dá) **與瘤旁組比較，P<0.01。

2.2 RT-PCR結(jié)果通過對(duì)馬來酸噻嗎洛爾作用時(shí)間和作用濃度分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的瘤體球細(xì)胞進(jìn)行第0、5、10天的細(xì)胞計(jì)數(shù)表明添加了不同濃度的馬來酸噻嗎洛爾(0、2、4 nM)對(duì)腫瘤球細(xì)胞的生長具有抑制作用，見表1。

表1 不同時(shí)期不同濃度的馬來酸噻嗎洛爾對(duì)腫瘤球細(xì)胞數(shù)

2.3 馬來酸噻嗎洛爾對(duì)VEGF合成的通路中的關(guān)鍵基因表達(dá)量的影響根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選取中間點(diǎn)第5天添加馬來酸噻嗎洛爾分別為0 nM和 2 nM的腫瘤球細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)量的驗(yàn)證。馬來酸噻嗎洛爾對(duì)腫瘤球細(xì)胞中所有驗(yàn)證基因表達(dá)量均出現(xiàn)了下調(diào)，CDC42、MAPK、PI3K基因表達(dá)水平均明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 2nM馬來酸噻嗎洛爾對(duì)血管瘤培養(yǎng)細(xì)胞CDC42、MAPK、PI3K表達(dá)的影響

3 討論

血管瘤是小兒最常見的由血管內(nèi)皮細(xì)胞大量增生引起的良性腫瘤。VEGF作為血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性生長因子，作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，參與血管瘤的發(fā)生和發(fā)展[5]。既往研究提示VEGF是血管瘤的作用靶點(diǎn)之一。

目前血管瘤的治療方式包括手術(shù)、藥物、同位素、激光等。而作為藥物治療的一種方法，應(yīng)用β-受體阻滯劑治療嬰幼兒血管瘤的安全性和有效性較好，有效率60%～90%，其中以普萘洛爾最為廣泛。但是該藥具有較高的脂溶性，易通過血腦屏障，臨床上部分患兒可出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)。理論上，局部用藥具有降低藥物使用劑量，增加局部組織藥物濃度，以及使用更方便、副作用更少等優(yōu)點(diǎn)，但也受藥物劑型、透皮吸收能力等影響較大。根據(jù)有學(xué)者M(jìn)eta分析的結(jié)果[8]，噻嗎洛爾局部外用治療血管瘤的療效較明顯，和口服普蔡洛爾治療血管瘤效果統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著差異。馬來酸噻嗎洛爾作為β-受體阻滯劑，可能通過抑制G蛋白偶聯(lián)的cAMP依賴蛋白激酶(PKA)的激活，從而抑制ERK/MAPK通路的激活，使VEGF分泌減少，降低血管瘤的成血管能力[9，10]。我們選取ERK/MAPK通路上的某些關(guān)鍵基因進(jìn)行表達(dá)量的驗(yàn)證。從細(xì)胞生長結(jié)果中非常明顯揭示了噻嗎洛爾能夠有效抑制血管瘤細(xì)胞VEGF的表達(dá)，說明噻嗎洛爾是作用很強(qiáng)的非選擇性β受體阻滯劑。下游表達(dá)基因PI3K的表達(dá)量減少說明激活G蛋白/MAPK級(jí)聯(lián)的激酶利用率下降，G蛋白偶聯(lián)受到抑制，從而抑制下游 MAPK 通路[11，12]。本研究結(jié)果提示馬來酸噻嗎洛爾可能通過抑制G蛋白偶聯(lián)，并且抑制ERK/MAPK通路的激活，使得VEGF分泌減少。

本研究初步揭示了馬來酸噻嗎洛爾抑制血管瘤細(xì)胞VEGF分泌的初步作用機(jī)制。這也提示我們是否可從ERK/MAPK通路上進(jìn)一步尋找更多可能的藥物作用靶點(diǎn)基因，通過聯(lián)合用藥或增加藥物透皮吸收的方式增強(qiáng)臨床治療效果。但是本研究僅僅是細(xì)胞水平的研究，存在一定的局限性，所以下一步我們會(huì)考慮將腫瘤細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi)，建立動(dòng)物模型的方式進(jìn)一步對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探究。