王彥敏 刁志虹 楊夢(mèng)華 都廣艷 高 毅

牙周炎是口腔科常見(jiàn)病、多發(fā)病，與全身多種系統(tǒng)性疾病密切相關(guān)。牙周炎是以牙槽骨進(jìn)行性吸收破壞、牙齒松動(dòng)為主要表現(xiàn)的疾病，牙周組織的恢復(fù)和重建是治療牙周炎的關(guān)鍵。牙周組織重建被定義為在組織學(xué)上有明顯的新生牙槽骨、牙周膜細(xì)胞等再附著于已喪失牙周組織的牙根表面。研究表明細(xì)胞因子在成骨細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程中有重要的調(diào)節(jié)促進(jìn)作用，血小板生長(zhǎng)因子（platelet derived growth factor，PDGF）因其在組織再生過(guò)程中發(fā)揮著積極的作用而受到廣泛的關(guān)注。筆者將補(bǔ)腎活血固齒方含藥血清作用于小鼠顱頂前成骨細(xì)胞（MC3T3-E1細(xì)胞），通過(guò)觀察該方劑對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞PDGF表達(dá)的影響，對(duì)補(bǔ)腎活血固齒方治療牙周炎的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

資料和方法

1.主要試劑：小鼠顱頂前成骨細(xì)胞亞克隆14（MC3T3-E1細(xì)胞）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)ATCC CRL-2594，α-MEM培養(yǎng)基（美國(guó)GIBCO公司），胰蛋白酶（Sigma），乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）（北京索萊寶科技有限公司）胎牛血清（PAA Laboraties GmbH），葉酸（Amresco），戊巴比妥（華北制藥有限公司股份）。小鼠血小板（PDGF）ELISA檢測(cè)試劑（北京江萊生物有限公司）。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)健康雄性SD系大鼠，280～300克20只，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：冀醫(yī)動(dòng)管字號(hào)SCXK（冀）2008-1-003。飼養(yǎng)條件：室溫保持在18℃～25℃，空氣流通，12h維持光照，動(dòng)物在籠中自由攝食飲水。飼料由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

3.MC3T3-E1細(xì)胞的培養(yǎng)：將購(gòu)置的MC3T3-E1細(xì)胞，吸去原培養(yǎng)液，PBS溶液清洗2遍，加入0.25%胰酶1ml，37℃消化1min，加α-MEM培養(yǎng)基1.5ml終止消化，反復(fù)吹打細(xì)胞，使其懸浮，移至15mL離心管，1000rpm離心5min，吸去上清液，加入培養(yǎng)基4.5ml，輕輕吹打，使管底細(xì)胞懸浮，均勻分散。取3個(gè)培養(yǎng)瓶，向每個(gè)培養(yǎng)瓶中滴入細(xì)胞懸液1.5ml，3個(gè)培養(yǎng)瓶置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，每3d換液1次。培養(yǎng)5至6天，細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底70～80%時(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用于下一步實(shí)驗(yàn)。

4.中藥成分及藥劑制備：藥物組成：淫羊藿15g、補(bǔ)骨脂15g、熟地黃10g、當(dāng)歸10g、丹參10g、知母10g、甘草3g。藥劑制備：藥物加10倍量蒸餾水煎煮1.5h，過(guò)濾；加同量蒸餾水重煎1.5h，過(guò)濾，合并濾液濃縮至150ml，裝袋備用。

5.實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分為3組：含藥血清組（A組）、無(wú)藥血清組（B組）、胎牛血清組（C組）。將20只280～300克SD大鼠隨機(jī)分為A組和B組，每組各10只。按4.875g生藥/kg體重計(jì)算用藥量。A組大鼠每天灌胃藥物2次，連續(xù)灌胃7d，最后1d第2次灌胃后間隔2h再次灌胃，末次灌胃1h后，1.2%戊巴比妥麻醉大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，每只大鼠的血液置于不同離心管中，冷置1h后，3000rpm離心20min，將各只大鼠離心管中的上清液置于同一離心管中混合以減少不同大鼠的個(gè)體差異，56℃滅活30min，濾菌器抽濾除菌后分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩組大鼠用等劑量生理鹽水灌胃，灌胃及血清制備方法同上。C組的血清購(gòu)買(mǎi)于PAA Laboraties GmbH。

6.用雙抗體夾心法（ELISA法）測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液小鼠PDGF水平：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MC3T3-E1細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸液，取3塊48孔板，將3組細(xì)胞分別接種于48孔板，每孔細(xì)胞15000個(gè)，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。培養(yǎng)2天后，3塊板均換用10%含藥血清，無(wú)藥血清，胎牛血清培基培養(yǎng)細(xì)胞，每塊板每組血清均設(shè)8個(gè)復(fù)孔。于培養(yǎng)24min，48min，72min各拿出一塊48孔板，收集所有孔內(nèi)培養(yǎng)液，5000rpm低溫離心30min，吸取上清液，-20℃保存?zhèn)溆谩?yán)格按小鼠血小板生長(zhǎng)因子（PDGF）試劑盒使用說(shuō)明書(shū)上的操作步驟進(jìn)行檢測(cè)，30min內(nèi)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)每孔OD值。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

含藥血清組（A組）培養(yǎng)上清液光密度值（OD值）明顯高于無(wú)藥血清組（B組）和胎牛血清組（C組）（表1），統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示差異有顯著性（P＜0.05）;無(wú)藥血清組（B組）和胎牛血清組（C組）相比，OD值無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。提示補(bǔ)腎活血固齒方能促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞分泌PDGF，參與促進(jìn)牙周膜細(xì)胞的增殖、分化，誘導(dǎo)新骨的形成，促進(jìn)牙槽骨的再生。

表1 ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中血小板生長(zhǎng)因子的表達(dá)（n＝8，mean±s）

討 論

牙周炎相當(dāng)于祖國(guó)醫(yī)學(xué)的“牙宣”、“齒衄”范疇。祖國(guó)醫(yī)學(xué)運(yùn)用中藥，尤其是補(bǔ)腎方治療牙齒松動(dòng)有著悠久歷史，臨床已證實(shí)補(bǔ)腎中藥治療牙周炎均取得了較好的臨床療效[1～3]。中醫(yī)辨證論治，注重對(duì)全身因素的調(diào)節(jié)，彌補(bǔ)了西醫(yī)主要針對(duì)細(xì)菌因素治療牙周炎的局限性[4]。筆者多年來(lái)應(yīng)用補(bǔ)腎活血固齒方治療牙周炎取得了良好的臨床療效，但其作用機(jī)理不明確[5～10]。

牙周炎是以牙槽骨進(jìn)行性吸收破壞、牙齒松動(dòng)為主要表現(xiàn)的疾病，牙周組織的恢復(fù)和重建是治療牙周炎的關(guān)鍵。牙周組織重建被定義為在組織學(xué)上有明顯的新生牙槽骨、牙周膜細(xì)胞等再附著于已喪失牙周組織的牙根表面。近年來(lái)研究表明細(xì)胞因子對(duì)成骨細(xì)胞的增殖和分化具有重要的調(diào)節(jié)促進(jìn)作用，在眾多細(xì)胞因子當(dāng)中，血小板生長(zhǎng)因子（platelet derived growth factor，PDGF）因其在組織再生過(guò)程中發(fā)揮著積極的作用而受到廣泛的關(guān)注。PDGF是一種激素類(lèi)生長(zhǎng)因子，主要存在于血小板的顆粒中。1997年Whitman等將血小板生長(zhǎng)因子應(yīng)用于局部口腔術(shù)后組織的修復(fù)，自此越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注于此方面的研究，并相繼驗(yàn)證了血小板生長(zhǎng)因子具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和組織修復(fù)的作用[11，12]。齊靜等[13]將主要成分為PDGF的富血小板血漿作用于體外培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PDGF能促進(jìn)牙周膜細(xì)胞增殖和ALP的活性。施六霞等[14]的研究也得到了相同的結(jié)論。大量的研究還發(fā)現(xiàn)，PDGF對(duì)成骨前體細(xì)胞、成骨細(xì)胞等都具有趨化作用，是趨化作用最強(qiáng)的骨生長(zhǎng)因子之一，它可以促進(jìn)骨的再生與修復(fù)，并且對(duì)骨前體細(xì)胞的增殖作用存在量效關(guān)系[15，16]。

補(bǔ)腎活血固齒方劑是以中醫(yī)傳統(tǒng)理論“腎主骨”為原則，治療腎精虧損型牙周炎的方劑。其組成：淫羊藿、補(bǔ)骨脂、熟地黃、當(dāng)歸、丹參、知母、甘草。當(dāng)歸、熟地黃、丹參以補(bǔ)血活血、滋補(bǔ)腎陰、生精補(bǔ)髓為君藥；淫羊藿、補(bǔ)骨脂以補(bǔ)腎、壯骨、強(qiáng)筋為臣藥；知母以滋腎瀉火，清熱除煩為佐藥；甘草以清熱解毒、調(diào)和諸藥為使藥。淫羊藿和補(bǔ)骨脂是傳統(tǒng)中醫(yī)常用的兩味補(bǔ)腎壯骨飲片，淫羊藿的主要有效成分是淫羊藿苷，有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化，抑制破骨細(xì)胞的分化的功能[17，18]；當(dāng)歸、熟地黃、丹參具有調(diào)節(jié)免疫功能，抵抗炎癥的作用[19～21]。知母能減少I(mǎi)L-1β、TNF等促炎介質(zhì)的產(chǎn)生，對(duì)骨質(zhì)流失起到一定的抑制作用[22]。

本研究發(fā)現(xiàn)，用補(bǔ)腎活血固齒方含藥血清培養(yǎng)小鼠顱頂前成骨細(xì)胞MC3T3-E1，細(xì)胞上清液中PDGF的檢出量明顯增加，提示該方劑可促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌PDGF，促進(jìn)牙周膜細(xì)胞的增殖分化，誘導(dǎo)新骨的形成，促進(jìn)牙槽骨的再生，這為補(bǔ)腎活血固齒方治療牙周炎提供了可能的理論基礎(chǔ)之一。