馮同富 陳德軍 葉常鴻 汪黎明 金晶 雷燕 李力

1湖北省婦幼保健院婦科（武漢430070）；2廣西醫(yī)科大學(xué)區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（南寧530021）

卵巢癌由于發(fā)病隱蔽、易轉(zhuǎn)移，成為致死率最高的婦科惡性腫瘤［1］。癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是一種涉及到多種分子機(jī)制的復(fù)雜生理病理過程。研究表明，視黃醇結(jié)合蛋白2（retinol?binding protein 2，RBP2）參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展過程［2-3］，但其和卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移是否存在關(guān)聯(lián)，目前國內(nèi)外還鮮有報(bào)道。因此，本研究選擇更易發(fā)生轉(zhuǎn)移的卵巢上皮癌耐藥細(xì)胞SKOV3/PTX，通過小分子干擾RNA 技術(shù)抑制RBP2 的表達(dá)，探討RBP2 基因沉默對卵巢癌上皮細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及質(zhì)粒卵巢癌SKOV3 細(xì)胞系及其紫杉醇（paclitaxel，PTX）耐藥細(xì)胞系SKOV3/PTX 細(xì)胞由廣西醫(yī)科大學(xué)惠贈。

1.1.2 試劑及儀器RT?qPCR 試劑盒購自美國In?vitrogen 公司；蛋白印跡法（Western blot）檢測試劑套裝購自上海Beyotime 公司；Matrigel 生物膠購自美國BD 公司；Transwell 小室購自美國Corning 公司；GAPDH、β?actin 及RBP2 抗體購自英國Abcam公司；β?catenin、VEGF、及MMP?2 抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購自美國ABI 公司，離心機(jī)購自德國Eppendorf 公司，熒光倒置顯微鏡購自日本Olympas 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染所有細(xì)胞均用含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。參照干擾效果最好的針對RBP2 基因的shRNA 和陰性對照shRNA?NC，建立重組慢病毒干擾載體，并轉(zhuǎn)染SKOV3/PTX細(xì)胞，48 h后利用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，再使用嘌呤霉素篩選，獲得穩(wěn)定傳染細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)分為三組，干擾組：感染沉默RBP2的慢病毒的SKOV3/PTX細(xì)胞（SKOV3/PTX?RBP2i）；陰性對照組：感染陰性對照慢病毒的SKOV3/PTX細(xì)胞（SKOV3/PTX?NC）；空白對照組：未感染的SKOV3/PTX 細(xì)胞（SKOV3/PTX）。

1.2.2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力取生長良好的、呈對數(shù)生長的三種細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為6 ×105cell/mL 并接種于六孔板，每孔1 mL，常規(guī)培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞密度達(dá)到90%左右，用槍頭進(jìn)行劃痕，用PBS 洗細(xì)胞3 次，然后放入培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，于0、24、48 h 拍照分析。

1.2.3 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力每組取3 × 105個(gè)細(xì)胞接種于transwell 小室表面，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后用70%冰乙醇溶液固定細(xì)胞1 h；用0.5%結(jié)晶紫染液染色20 min，PBS 清洗后顯微鏡下觀察拍照。計(jì)算侵襲細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.4 RT?PCR 法檢測細(xì)胞中的基因表達(dá)取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，離心后收集細(xì)胞，Trizol 法提取總RNA 并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，引物序列：β?catenin 上游：5′?CAAGTGG?GTGGTATAGAGG?3′，下游：5′?AGTCCATAGTGAA?GGCGAAC?3′；VEGF 上游：5′?ATCCAATCGAGACC?CTGGTG?3′，下游：5′?ATCTCTCCTATGTGCTGGCC?3′；MMP?2 上游：5′?ACCACAGCCAACTACGATGA?3′，下游：5′?GCTCCTGAATGCCCTTGATG?3′；內(nèi)參GAPDH 上游5′?TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT?3′，下游5′?TTACTTCGTCCAACCACCGA?3′。擴(kuò)增條件：50 ℃2 min，95 ℃10min；95 ℃30 s，60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)，以GAPDH 為內(nèi)參計(jì)算RBP2 的相對表達(dá)量，繪制溶解曲線，最終數(shù)據(jù)以2?△△Ct進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.5 Western blot法檢測細(xì)胞中的蛋白表達(dá)提取各組總蛋白并檢測蛋白濃度。根據(jù)各組蛋白濃度上樣，以90 V 電壓進(jìn)行SDS?PAGE 電泳，分離后轉(zhuǎn)膜、封閉，1 h 后加入相應(yīng)的一抗4 ℃孵育過夜。第2 天，將膜取出并以TBS 清洗3 次，加入二抗室溫孵育2 h；然后，TBS 緩沖液洗滌3 次，最后放入TBST 中漂洗10 min。在凝膠成像系統(tǒng)利用超敏ECL 化學(xué)發(fā)光底物曝光顯影，存儲圖片。以GAP?DH 作為內(nèi)參照分析目的蛋白的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以表示，計(jì)量資料兩組間比較采用t檢驗(yàn)，兩組以上的組間比較采用單因素方差分析法，組內(nèi)兩兩多重比較采用SNK?q檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RBP2基因表達(dá)沉默的SKOV3/PTX細(xì)胞系的鑒定建立穩(wěn)定干擾RBP2 表達(dá)的細(xì)胞株SKOV3/PTX?RBP2i 后采用Western blot 法進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染重組載體后，SKOV3/PTX?RBP2i 細(xì)胞中RBP2 的蛋白表達(dá)水平明顯低于SKOV3/PTX?NC 細(xì)胞及SKOV3/PTX 細(xì)胞，見圖1。說明RBP2 基因表達(dá)沉默的SKOV3/PTX 細(xì)胞系構(gòu)建成功。

圖1 RBP2 基因表達(dá)沉默細(xì)胞系SKOV3/PTX?RBP2i 蛋白水平的鑒定Fig.1 The silence effect on protein level in SKOV3/PTX?RBP2i

2.2 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析提示，SKOV3/PTX?RBP2i 細(xì)胞、SKOV3/PTX?NC 細(xì)胞及SKOV3/PTX 細(xì)胞在24、48 h 的劃痕愈合率分別為（37.74±3.61）%、（55.87±4.21）%；（75.24±3.16）%、（95.66±4.06）%；（72.38±2.83）%、（98.24±3.15）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 218.063，P＜0.01；F=198.173，P＜0.01），且沉默組均于陰性對照組及空白對照組（24 h：q= 25.031，P＜0.01；q= 26.090，P＜0.01，48 h：q= 23.382，P＜0.01；q= 25.274，P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但SKOV3/PTX?NC 細(xì)胞與SKOV3/PTX細(xì)胞之間，劃痕的愈合率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

2.3 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析體外侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，沉默組、陰性對照組和空白對照組的穿膜細(xì)胞數(shù)量分別為（24.13±3.39），（63.32±3.81），（66.43±3.58），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=128.842，P＜0.01）。其中，陰性對照組和空白對照組的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯高于沉默組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q= 18.869，P＜0.01；q=20.366，P＜0.01），見圖3。

圖2 各組細(xì)胞的劃痕愈合情況Fig.2 Healing ability of each groups

圖3 各組細(xì)胞的侵襲情況Fig.3 Invasionability of each groups

2.4 β?catenin、VEGF 及MMP?2 在三組細(xì)胞中的表達(dá)情況RT?PCR 檢測提示，沉默組、陰性對照組和空白對照組的β?catenin、VEGF 及MMP?2 的mRNA 表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 10.443，P＜0.05；F=11.681，P＜0.01；F=30.645，P＜0.01），且上述三個(gè)指標(biāo)在沉默組SKOV3/PTX?RBP2i 細(xì)胞中的表達(dá)水平均低于陰性對照組SKOV3/PTX?NC細(xì)胞和空白對照組SKOV3/PTX 細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Western blot 法檢測顯示，沉默組、陰性對照組和空白對照組的β?catenin、VEGF及MMP?2 的蛋白表達(dá)水平差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 22.144，P＜0.01；F= 45.068，P＜0.01；F=16.579，P＜0.01），同樣，三個(gè)指標(biāo)在陰性對照組和空白對照組的表達(dá)水平均低于沉默組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 各組細(xì)胞中β?catenin、VEGF 及MMP?2 的表達(dá)Fig.4 Expression of β?catenin、VEGF and MMP?2 proteins in each groups

3 討論

惡性腫瘤是威脅人類健康的嚴(yán)重疾病。局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最主要的生物學(xué)特性，而且是導(dǎo)致患者死亡的主要原因［4］。卵巢癌作為常見的婦科惡性腫瘤之一，更易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，因此，其5年生存率僅為35%［5］?？朔殉舶┑那忠u性和轉(zhuǎn)移性成為延長卵巢癌患者生存期的關(guān)鍵所在。RBP2 具有組蛋白去甲基化轉(zhuǎn)移酶的活性，它廣泛參與了腫瘤的發(fā)生［6］、分化［7］及轉(zhuǎn)移［8］等生物學(xué)行為。目前，RBP2 在卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用相對研究較少，探討其在卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用和分子機(jī)理有著重要的研究意義。一般而言，卵巢癌耐藥細(xì)胞較親本細(xì)胞更容易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，本研究在卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV3/PTX 中敲低RBP2 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)RBP2 表達(dá)受到抑制后，卵巢癌細(xì)胞的遷移能力極大下降。侵襲實(shí)驗(yàn)也表明干擾RBP2 的表達(dá)可以顯著降低SKOV3/PTX 細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，本研究初步證實(shí)RBP2 參與了卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程及調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，目前，已發(fā)現(xiàn)FAK/ERK1/2/MMP9/NANOG/SOX9［9］、PI3K/Akt［10］、Wnt/β?catenin［11］、MAPK/JNK/p38［12］等多條信號通路與卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其中Wnt/β?catenin 信號通路可能是較為重要的一條，它在卵巢癌的發(fā)生、耐藥及轉(zhuǎn)移中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用［13-14］。為了明確RBP2 是否通過Wnt/β?catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移，本實(shí)驗(yàn)研究了Wnt/β?catenin 信號通路中的3 個(gè)重要信號蛋白，即β?catenin、VEGF 與MMP?2 的表達(dá)水平和RBP2 間的關(guān)系。結(jié)果表明，當(dāng)沉默RBP2 基因后卵巢癌細(xì)胞中β?catenin、VEGF 與MMP?2 的mRNA及蛋白水平表達(dá)均顯著降低，這充分說明，RBP2基因可能通過Wnt/β?catenin 通路調(diào)節(jié)β?catenin、VEGF 與MMP?2 的表達(dá)進(jìn)而影響卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。借助這一信號途徑，RBP2 對癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)得到級聯(lián)放大的效果。因?yàn)棣?catenin作為上游分子可以通過多個(gè)下游因子直接或間接的影響細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。ZHU 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，β?catenin 在卵巢癌細(xì)胞中可經(jīng)由PRR11（proline?rich protein 11）影響MMP?2 的表達(dá)，進(jìn)而影響卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲。另有體外研究［16］表明，利用siRNA 靶向沉默β?catenin 基因阻斷Wnt/β?catenin信號通路能明顯抑制子宮內(nèi)膜異位癥模型裸鼠異位內(nèi)膜組織VEGF 和MMP?9的表達(dá)及血管生成。VEGF 可以通過刺激腫瘤相關(guān)的血管生成來促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，因此，VEGF 的表達(dá)水平一定程度上和腫瘤的惡性程度密切相關(guān)［17］。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF?C 和VEGF?D 可促進(jìn)腫瘤淋巴管的生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散［18］，而且VEGF?C還與患者的生存率密切相關(guān)。卵巢癌患者腹膜后腫瘤的進(jìn)展與VEGF?C 的高表達(dá)有關(guān)，VEGF?C 高表達(dá)患者的總體生存率明顯低于低表達(dá)患者［19］。MMP?2 也是與腫瘤侵襲和遷移密切相關(guān)的重要蛋白酶之一。LI 等［20］研究證實(shí)，MMP?2 的表達(dá)增加可以促進(jìn)卵巢癌A2780 細(xì)胞的侵襲和遷移，而用有關(guān)抑制劑抑制其表達(dá)后，卵巢癌A2780 細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯下降。由于VEGF 和MMP?2和腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，所以同時(shí)降低VEGF與MMP?2 的表達(dá)可以顯著抑制卵巢癌上皮細(xì)胞的遷移和侵襲［21］。另外，一項(xiàng)關(guān)于直腸癌的研究表明，患者血清中VEGF 和MMP?2 的表達(dá)與腫瘤的浸潤深度、Dukes 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示VEGF 和MMP?2 的水平可作為判斷腫瘤患者預(yù)后和預(yù)測是否轉(zhuǎn)移的有效指標(biāo)［22］。

綜上所述，本研究從細(xì)胞層面初步證實(shí)RBP2參與了卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲，其機(jī)制可能和Wnt/β?catenin 信號通路有關(guān)，但其如何啟動Wnt/β?catenin 通路的信號傳導(dǎo)及與其它促腫瘤轉(zhuǎn)移因子間的作用等還需后續(xù)研究尤其是動物實(shí)驗(yàn)的探討和驗(yàn)證。